荧光差异显示PCR克隆参与胃腺癌转移的基因wcl1

使用来源于同一个胃腺癌病人的原发灶RF 1(ATCC编号CRL 186 4 )和转移灶RF 4 8(ATCC编号CRL 186 3)作为研究肿瘤转移的模型 .通过荧光差异显示PCR(FDD PCR)技术 ,克隆了 4 5个涉及胃腺癌转移相关基因 .和原发灶CRL 186 4相比 ,发现在转移灶CRL 186 3细胞中有 38个基因被显著上调 ,7个基因被显著下调 ,包括未被发现的基因 3个 .利用生物信息学技术对其中 1个在RF 4 8中高度上调的wcl1进行克隆和鉴定 ,发现wcl1的cDNA全长为 6 6 4bp ,含有 1个 2 4 0bp的完整阅读框 .用RT PCR和Northern印迹证实 ,结果与克隆拼接的大小完全一致 (NCBI数据库收录号AF36 4 86 3) .wcl1编码肽位于胞浆内含 79个氨基酸 ,理论上的pI Mr:5 2 8 896 1 72 .氨基酸序列分析发现 ,其N端 4～ 5 5氨基酸处为未知功能区UPF0 0 16蛋白 ,5 7～ 78处有一段亮氨酸拉链结构域 ,未发现与已知的蛋白质有高度的同源性 .该基因定位于 11q14.组织分布表明 ,wcl1除在分化差的胃腺癌中的表达要高于相应的正常胃组织 ,在微血管内皮中表达也明显高于乳腺管癌、脑纤维状星形细胞瘤 ,未检测到在其它组织有分布 .研究提示 ,Wcl1可能为胃腺癌转移过程中参与核内基因转录的相关蛋白质 .     

免疫核糖核酸——转移免疫信息的物质

致敏淋巴细胞含有两类转移免疫信息的物质,一类为可透析的转移因子(Transfer factor, TF);另一类为不可透析的免疫核糖核酸(Immune RNA, iRNA),这是两类具有重要潜能     

人体白细胞转移因子和“免疫”核糖核酸的联合抽提法——Ⅱ.“免疫”核糖核酸

本文继续介绍联合抽提法的第Ⅱ部分“免疫”核糖核酸(iRNA)的抽提。将白细胞匀浆沉淀残渣按Scherrer和Darnell的十二烷基磺酸钠加苯酚的热抽提法抽提。每克白细胞可得iRNA1～2毫克。A_(260)/A_(230)=2.05～2.26,A_(260)/A_(280)=2.03～2.20。RNA含量为48.33±4.72%,DNA含量为4.31±2.53%,蛋白质为2.76±0.32%,糖原含量为42.92±9.92%。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示五条区带,相当于4S、83、9S、15S和20S。冻干的iRNA制剂经动物实验证明无毒性、无热原和无过敏性,但对家兔具有抗原性。制剂经RNase、DNase或pronase处理后与抗血清仍有沉淀反应,但经唾液淀粉酶处理后沉淀线消失。所以认为抗原性系由制剂中所含糖原所引起。溶于肝素溶液的制剂注射于病人,能提高其迟发型皮肤变态反应及细胞免疫反应。     

RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构与功能

ＲＮＡ聚合酶Ⅲ (ｐｏｌⅢ )是真核生物催化合成ｔＲＮＡ和 5ＳｒＲＮＡ及一些核小ＲＮＡ和胞质ＲＮＡ必需的酶。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ能够识别ｔＲＮＡ基因中一些高度保守的特征性ＤＮＡ序列而启动下游ＤＮＡ的转录 ,这些序列称为ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子不仅广泛存在于真核细胞中ｔＲＮＡ、Ｕ6核小ＲＮＡ(ＳＮＲ6 )等的基因中 ,也是病毒催化合成一些小片段ＲＮＡ如腺病毒ＶＡＲＮＡ所必需的。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子因其能在体内外高效快速地转录某些小片段基因 ,已被人们广泛地应用于核酶和反义ＲＮＡ技术中 ,在众多的ＲＮＡ…     

脂质体介导含IL-2及IFN-γ cDNA腺相关病毒质粒的转基因及抗肿瘤作用

h IL- 2基因和 m IFN- γ基因经 IRES连接后克隆入腺相关病毒质粒表达载体 p AC中 ,构建得双基因质粒表达载体 p AC- FRI.体外经阳离子脂质体 Dosper介导转染小鼠肝癌细胞 MM45T.Li,Northern印迹及生物活性检测分别从 RNA水平和蛋白质水平证明了 2个基因的表达 .直接瘤内注射 Dosper- DNA复合物后 ,与对照组 ( Lac Z)相比 ,双基因组及 IL- 2或 IFN-γ单基因组均产生了较明显的抗瘤作用 ,并诱发了较高的特异 CTL活性 .     

利用Taq DNA聚合酶对PCR产物直接进行顺序分析

Taq DNA聚合酶具有反应速度快、温度作用范围广及良好的续进性等特点,可视为一种理想的DNA顺序分析酶。本文首先对非对称性PCR扩增过程中单、双链DNA产物的积累情况进行了分析,然后采用标记延伸二步法,对Taq DNA聚合酶的性质及影响因素进行分析。为进一步改进Taq DNA聚合酶测序的方法,本反应建立了“Klenow-型”的直接掺入标记同位素测序法,即在反应液中加入与标记核苷酸相应的一定浓度的冷dNTP。此法不但解决了二步法中引物后部分DNA顺序无法读出的缺点,而且简化了反应步骤,亦能得到令人满意的顺序分析结果,每次可读出至少400碱基的序列。     

多等位基因PCR-SSO反相杂交法及其在HLA-DR_4亚型结构分析中的应用

本文介绍一种适合于多等位基因定型和结构分析的反相顺序特异性寡核苷酸探针杂交方法。将化学合成的多种探针分别经脱氧核苷末端转移酶(TdT)催化,于3′端加上100个以上碱基的Poly(dT)尾,然后将各探针分别以斑点固定于同一张尼龙膜上。用PCR法对该基因位点进行扩增,扩增的同时加入α-~(32)P-dCTP以直接参入放射标记,然后将PCR产物与膜固定探针杂交,以四甲基氯化铵根据探针长度统一洗涤温度。该方法克服了以往对同一份样品进行多个等位基因检测时需要进行多次探针标记和杂交的缺点。我们用该方法对中国人群MHC-Ⅱ类DR4多等位基因进行了研究。     

单纯疱疹病毒的PCR直接基因分型

本文利用ＰＣＲ技术建立一种对ＨＳＶ直接基因分型的方法。在ＨＳＶ－Ⅰ、Ⅱ两型的ＤＮＡ多聚酶基因上设计了一条两型共同的上游引物（ＨＤＰ－Ｂ）和两条型特异的下游引物（ＨＤＰ－１、ＨＤＰ－２）。三条引物共同组成一个扩增反应体系,在ＨＳＶ－Ⅰ产生５４３ｂｐ条带,ＨＳＶ－Ⅱ产生３７２ｂｐ条带,据此在基因水平上对ＨＳＶ进行分型。５株不同来源的ＨＳＶ（２株Ⅰ型,３株Ⅱ型）分型结果与病毒分离及血清学方法完全一致。该反应体系与其它来源的ＤＮＡ不产生特异反应,敏感性可达１ｆｇ。应用该法对１５１份临床可疑ＨＳＶ感染的标本进行检测并分型,结果与免疫学方法完全一致。     

细胞内RNA的原位杂交

本文介绍用原位杂交方法测定细胞内的RNA。该方法特异性较高,能保持细胞曲完整性。我们测定了不同细胞的rRNA基因的转录和原癌基因c-myc,c-H-rgs的转录,取得了较满意的结果。RNase处理细胞或质粒pBR322作探针,细胞中显影颗粒很少。本文对原位杂交方法学进行了初步的讨论。