非核糖体肽合成酶的末端硫酯酶与多肽环化

非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPSs）能以多载体巯基化模板机制合成各种结构复杂、种类繁多的次生代谢非核糖体环肽.根据环肽末端环化的方式,可分为两大类：大环内酯型和内酰胺型.负责非核糖体环肽最终环化的硫酯酶（thioesterase,TE）属于α/β水解酶超家族.该家族包括：脂酶、蛋白酶、酯酶等,其共有特征是含有保守的催化三元件（Ser-His-Asp）,起到终止反应和释放产物的功能. TE具有区域定向性（regiospecific）、化学定向性（chemospecific）及立体定向性（stereospecific）的特点,在非核糖体肽（nonribosomal peptide,NRP）的合成反应中具有决定性作用,直接影响到最终环肽的生成. 同时,TE由于其特有的环化和水解的双重活性,在体外的线性多肽环化中越来越受到众多学者的关注. 综合国内外相关文献,本文着重从TE介导下的产物释放机制和影响因素两个方面综述非核糖体末端硫酯酶的研究进展及其应用.     

象山港小型底栖动物群落结构及其与环境因子的相关性

为阐明象山港小型底栖动物群落的结构和组成,于2011年10月(秋)、2012年2月(冬)、5月(春)和8月(夏),对小型底栖动物进行12个站位的取样分析,结果表明:共鉴定出12个类群,包括线虫、介形类、双壳类、腹足类、寡毛类、多毛类、涡虫类、桡足类、端足类、涟虫类、水螅幼体和其他类。春、夏、秋、冬各季节的小型底栖动物平均丰度分别为(22.3±34.4)个/10 cm~2、(74.8±140.8)个/10 cm2、(31.4±64.5)个/10 cm~2和(97.4±206.5)个/10 cm~2,且以线虫和介形类为主要优势类群;相应季节的平均生物量分别为(73.0±144.4)μg/10 cm~2、(1261.7±2244.1)μg/10 cm~2、(440.7±1003.7)μg/10 cm~2和(1010.5±2365.6)μg/10cm~2,介形类为主要贡献类群。相似性分析(ANOSIM)显示,各季节间小型底栖动物群落结构差异显著(R=0.085,P=0.001)。据小型底栖动物全年平均丰度的MDS分析,在空间上将12个站位分成3组,其中,港底区组分别与其他2组群落结构差异显著,这些组间的主要差异类群是介形类、线虫、腹足类和多毛类。同时,对相应样品的14个沉积环境因子(水深、温度、盐度、水份、有机碳、叶绿素a、pH值、氧化还原电位、电导率、溶解固体,以及沉积物的砂、粉砂、粘土含量和中值粒径)进行了监测,结果发现,象山港沉积物以粘土和粉砂为主,中值粒径在港口区较高。沉积物中,有机碳季节间差异明显,春、夏有机碳含量高于秋、冬季节;而叶绿素a含量在春季和港底区较高。据生物-环境(BIOENV)分析,小型底栖动物与环境因子间相关系数仅为0.270,筛选的变量子集为砂含量、含水率、水深和中值粒径。进一步的spearman相关分析显示,小型底栖动物丰度与叶绿素a和砂含量呈显著正相关,与水深、盐度呈显著负相关;小型底栖动物生物量与砂含量呈显著正相关,分别与盐度、粉砂含量呈显著负相关。主要类群线虫丰度与叶绿素a呈显著正相关,而介形类丰度与砂含量呈显著正相关,分别与氧化还原电位、盐度呈显著负相关。寡毛类、桡足类与环境因子间均未检出显著相关性。     

红藻糖苷对超低温冻存微藻的保护作用

为研究红藻糖苷对超低温冻存微藻细胞的保护作用,研究将3种不同的微藻置于含10% DMSO和不同浓度红藻糖苷的冻存液中,冻存并解冻后,以流式细胞仪检测细胞存活率,测定复养后藻株的生长曲线及相关生理参数。结果显示,由于冷冻损伤,冻存后各种藻细胞的生长速率、细胞密度及生理指标都显著性下降,而红藻糖苷协同DMSO能够显著增加细胞的存活率,尤其15%红藻糖苷能将紫球藻存活率提升20%（P0.05）;生长曲线得到明显改善;且对PSII最大光能转化效率也有显著性提高（P0.05）。总体结果来看,红藻糖苷对超低温冻存微藻,特别是紫球藻具有明显的保护作用,且效果强于蔗糖。     

基于谷氨酸消旋酶基因(murI)构建杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株的染色体-质粒平衡致死表达系统

【目的】构建一种基于谷氨酸消旋酶(MurI)基因的染色体-质粒平衡致死系统,用于杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株(Pseudomonas plecoglossicida ΔtssD-1, Pp ΔtssD-1)中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供新的思路和方法。【方法】利用同源重组技术,将亲本株Pp ΔtssD-1中的murI基因敲除,构建murI基因缺失突变株;将广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-2的卡那霉素抗性基因替换为murI基因,构建平衡致死质粒(即无抗性回补质粒);在平衡致死质粒的多克隆位点处插入绿色荧光蛋白以检测外源抗原是否稳定表达,对重组菌株进行生物学特性分析,包括生长曲线、质粒稳定性和外源抗原表达水平。【结果】murI基因缺失株在不含D-谷氨酸的LB培养基上无法生长;无抗性回补株在不含D-谷氨酸的LB培养基上恢复了生长能力,但生长速度低于亲本株;经鉴定外源抗原可在无抗性质粒中稳定表达,并可在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,平衡致死质粒在重组菌株中具有良好的遗传稳定性。【结论】本研究以murI为靶点构建了新型的染色体-质粒平衡致死系统,可在无抗性筛选条件下在Pp ΔtssD-1中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供了新的策略和方法。     

绿色杜氏藻不同β-胡萝卜素羟化酶基因家族胁迫应答模式研究

β-胡萝卜素羟化酶(β-carotenoid hydroxylase, CHYB)是植物类胡萝卜素生物合成途径中的一个重要限速酶。本研究对绿色杜氏藻转录组测序数据进行分析,获得2条β-胡萝卜素羟化酶家族基因chyb1和chyb2。采用染色体步移法分别克隆并获得了绿色杜氏藻chyb1和chyb2基因的启动子序列,全长分别为1080 bp(GenBank登录号：KY012338)和1155 bp (GenBank登录号：KY012339)。利用Plantcare软件分析两个启动子的顺式作用元件,结果表明绿色杜氏藻chyb1基因启动子含有与甲基茉莉酸、花生四烯酸、水杨酸等非生物胁迫相关的顺式作用元件,而绿色杜氏藻chyb2基因启动子含有与光照相关的顺式作用元件。通过qRT-PCR分析了绿色杜氏藻CHYB基因家族在不同胁迫下的基因表达水平,结果表明该基因家族的基因表达水平与启动子调控相关,且不同的家族基因应答不同的胁迫。     

海带藻际微生物抗菌活性及其多样性的初步研究

从浙江台州海域健康海带、病烂海带(Laminaria japonica)及其周围海水中分离纯化海带藻际微生物, 利用双层琼脂扩散法对获得的菌株进行抗菌活性筛选, 比较活性菌株与来源的相关性, 并对具有抗菌活性的菌株进行16S rRNA系统发生学分析。结果显示, 在分离的143株海带藻际微生物中, 有42株细菌具有抗菌活性, 其中来源于健康海带和海水的活性菌株比例(35%和29%)大于来源于病烂海带的细菌(23%)。对其中16株具有广谱抗菌活性的菌株进行的16S rRNA系统发生学分析显示, 分别属于Pseudoalteromonas、Rahnella、Donghaeana、Bacillus和Exiguobacterium 5个属。为从藻际微环境的微生物多样性入手了解海带病烂机制以及寻找新的抗菌药物提供研究材料。       

外套膜转录物组分析揭示尿素在贻贝耐受海水酸化中的作用

海洋酸化是目前地球面临的主要环境问题之一,对海洋矿化生物的生存带来严重威胁。贝类是目前海水养殖的主要物种,海洋酸化会对贝壳的生物矿化过程产生抑制,因而对贝类养殖业的发展带来严重影响。前期研究中已发现,尿素对贻贝贝壳的形成具有辅助作用,推测尿素有助于贻贝在海洋酸化背景下的生存。为进一步探究尿素通过何种分子机制对贻贝耐受海洋酸化产生积极影响,以厚壳贻贝外套膜为研究对象,采用转录物组学策略分析了尿素添加对贻贝外套膜组织在酸化海水中的基因表达量变化的影响。结果表明,尿素添加对贻贝外套膜在酸化条件下的转录物组变化具有逆转趋势,可抑制外套膜中受酸化胁迫而激活的细胞自噬、凋亡、以及免疫应激相关通路;同时,也诱导了部分贝壳基质蛋白质表达量的上调,从而有助于维持贻贝在酸化条件下的生物矿化过程。上述研究有助于了解贻贝对海洋酸化的耐受性机制,也为后续贝类养殖业在海洋酸化背景下的健康发展提供了新的思路。     

一种快速检测微囊藻毒素mcyG基因的新技术——环介导恒温扩增

利用环介导恒温扩增(LAMP)技术,以微囊藻毒素(Microcystins,MCs)合成基因簇中的mcyG基因为靶序列,设计了1 套LAMP引物,建立了LAMP反应体系并进行灵敏度和特异性实验。结果表明mcyG基因的最低检测限为:24 cfu/mL,远低于常规PCR(Polymerase Chain Reaction)。整个检测过程仅需40 min,且可直接目测结果。特异性实验中, 13 株淡水常见水华蓝藻分属:色球藻属(Chroococcus)、念珠藻属(Nostoc)、鱼腥藻属(Anabaena)、束丝藻属(Aphanizomenon)、微囊藻属(Microcystis),其中10 株呈阳性反应, 3 株为阴性。在野外样品检测中,来自太湖与黄庆苗池塘的水样PCR检测显示阴性反应,而LAMP检测均呈阳性反应,提示此两处水样中可能含有产毒微囊藻,显示出了LAMP检测方法良好的野外检测和预警能力。综合上述,LAMP检测方法能够快速检测产微囊藻毒素的关键基因,且结果可视化。该方法简便、快捷、不依赖特殊检测设备,极具推广前景。     

不同干燥方式、存储温度对羊栖菜中岩藻黄素稳定性的影响

为探究不同干燥方式、不同存储温度和存储时间对羊栖菜中岩藻黄素稳定性的影响,本研究考察了三种不同干燥方式,包括自然阴干、低温烘干和冷冻干燥,对羊栖菜中岩藻黄素稳定性的影响。结果表明采用冷冻干燥所得羊栖菜,含水量低,岩藻黄素含量高,达到699.2μg/g,岩藻黄素保留率为94.7%,远高于自然阴干及低温烘干。因此,冷冻干燥是最佳干燥方法。考察了四个不同温度(-20、4、25、30℃)存储对冻干羊栖菜中岩藻黄素稳定性的影响,结果表明随着存储温度的升高,岩藻黄素的降解率明显增高,因此,-20℃为最佳储存温度。