一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

早期非小细胞肺癌患者血清巨噬细胞抑制因子-1、趋化素与临床病理特征及预后的关系

目的:探讨早期非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)、趋化素(chemerin)水平与临床病理特征及预后的关系。方法:选择72例NSCLC患者(NSCLC组)、53例肺良性疾病患者(良性组)、50例体检健康人群(对照组),分别检测血清MIC-1、chemerin水平,分析血清MIC-1、chemerin水平与NSCLC患者临床病理参数的关系。Kaplan-Meier法分析不同血清MIC-1、chemerin水平NSCLC患者生存时间的差异,COX比例风险回归分析血清MIC-1、chemerin水平与NSCLC患者预后的关系。结果:NSCLC组患者血清MIC-1、chemerin水平高于良性组和对照组(P0.05)。血清MIC-1水平与NSCLC患者年龄、目前吸烟、肿瘤直径、TNM分期、分化程度、复发或转移、生存状态有关(P0.05),chemerin水平与NSCLC患者目前吸烟、TNM分期、复发或转移、生存状态有关(P0.05)。高MIC-1水平患者生存率低于低MIC-1水平患者(P0.05),高chemerin水平患者生存率低于低chemerin水平患者(P0.05)。COX比例风险回归分析结果显示:血清MIC-1、chemerin、TNM分期与NSCLC不良预后独立相关。结论:血清MIC-1、chemerin水平与NSCLC患者部分临床病理参数和预后相关,可作为早期NSCLC患者预后预测的潜在指标。     

成纤维细胞生长因子21对非酒精性脂肪性肝炎的作用及机制的研究

目的:探索成纤维细胞生长因子21(FGF-21)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的作用及其机制。方法:用浓度为500μmol/L的油酸和棕榈酸混合物(摩尔比=2:1)诱导HepG2细胞建立NASH细胞模型,实验分为5组:正常对照组(Control)、模型组(Model)、低剂量FGF-21组(LFGF-21,0.5μmol/L)、中剂量FGF-21组(MFGF-21,1.0μmol/L)和高剂量FGF-21组(HFGF-21,2.0μmol/L),油红O染色法观察细胞内脂滴,全自动生化分析仪检测细胞内ALT、AST、TC、TG的水平,Real-time PCR和Western blot分别检测细胞内核因子E2相关因子-2(Nrf-2)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)的m RNA和蛋白水平,ELISA检测IL-1β、TNF-α水平。结果:NASH细胞造模成功,油红O染色结果显示对照组细胞无明显脂滴蓄积,模型组细胞内可见大量橘红色脂滴,并出现融合现象。不同浓度FGF-21治疗组的细胞内红色脂滴明显减少,并呈剂量依赖性。模型组ALT、AST、TC、TG、IL-1β、TNF-α和NLRP3的水平均高于对照组(P0.05),FGF-21治疗组其水平低于模型组(P0.05)。模型组Nrf2的水平低于对照组(P0.05),FGF-21治疗组Nrf2的水平高于模型组(P0.05)。结论:FGF-21通过促进Nrf-2、抑制NLRP3减少非酒精性脂肪性肝炎细胞的脂质沉积,减轻炎症反应,对NASH有保护作用。     

葛根素联合小檗碱干预非酒精性脂肪性肝炎两种动物模型的病理学研究

目的:从病理学的角度探讨葛根素及小檗碱对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的干预作用。方法:制备高脂饮食诱导的SD大鼠NASH模型及蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的C57BL/6小鼠NASH模型,各给药组造模并同时灌胃给药,大鼠持续8周后取材,小鼠持续2周后取材。肝组织制成石蜡切片进行HE染色,制成冰冻切片进行油红O染色,经光镜观察摄片后,采用NAFLD活动度积分对各组进行NASH评估。结果:HE及油红O检测提示葛根素联合小檗碱可减轻两种NASH动物模型肝脏的脂肪变性、抑制肝细胞空泡化的发生,减少肝小叶内炎性病灶的数量。给予葛根素联合小檗碱的SD大鼠NAS总分为2.60±0.52(3),给予葛根素联合小檗碱的C57BL/6小鼠NAS总分为2.80±0.79(3),均已排除NASH。结论:葛根素联合小檗碱可显著抑制NASH相关病理变化的发生发展,对NASH具有一定的干预作用。     

长链非编码RNA及其与疾病相关性的研究进展*

人类基因组中,用于蛋白质编码的核酸序列约占1.5%,另外98.5%的非蛋白编码基因被视为"噪音"序列,并未引起人们的注意。随着测序技术的发展,人们发现大部分的基因被转录成RNA,其中多数为长度大于200nt且不编码蛋白质的长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA),其作用机制包括支架分子、引导分子等,广泛参与细胞发育、增殖及迁移过程,且其水平的改变又与肿瘤、代谢性疾病等相关。本文主要对lncRNA的分类、作用机制及涉及的疾病等进行综述,为进一步研究lncRNA的功能机制奠定基础。     

基于脂质组学技术研究急性缺血性脑卒中临床诊断标志物

目的:急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke, AIS)是由于血流减少导致的脑功能突然丧失。由于AIS发病机制是异质性和多因素的,我们建立全面的脂质组学方法来阐明AIS进程相关的脂质变化和复杂的脂质代谢网络。方法:选取26例AIS患者血液标本和27例健康志愿者血清作为研究对象,进行总脂抽提,通过基于LC-MS策略的非靶向脂质组学方法进行规模性、整体性的脂质组学分析。结果:对AIS患者和健康志愿者血浆进行大规模脂质定性定量分析,通过Progenesis~? QI软件分析Xevo~? G2-XS QTOF质谱系统MSE采集的子离子数据,精确定量到1054个脂质特征差异,准确定性得到368个脂质分子,多变量统计分析中差异脂质组成能将AIS患者和健康志愿者区分开来,通路富集分析图显示差异脂质主要参与甘油磷脂代谢的紊乱。结论:AIS患者血浆脂质组成与健康志愿者存在显著差异,差异表达的脂质可能与AIS发生有关。这些发现有助于开发新的诊断标志物和AIS治疗靶点。     

MAPKs对磷酸酶MKP1-CD催化的激活作用研究

目的:丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases, MAPKs)是细胞内重要的信号传导通路,双位点特异性磷酸酶(Mitogen-activated Protein Kinase Phosphatases, MKPs)去磷酸化MAPKs,负调控MAPKs的信号传递。在MKPs去磷酸化MAPKs的过程中,MAPKs同时会激活部分MKPs的催化能力,MKP1便是其中之一。本文旨在比较三种经典MAPKs底物,ERK2、JNK1和p38α对MKP1磷酸酶催化能力的激活效果,进一步理解MAPKs与MKP1的底物特异性机制。方法:以p NPP为底物,检测在不同浓度的非磷酸化ERK2、JNK1和p38α存在下,MKP1-CD催化结构域片段蛋白质去磷反应速度的变化,对比所得的动力学参数以确定MAPKs对MKP1激活程度的差异。结果:ERK2和JNK1能够激活MKP1的催化活力,将催化速率提升1.5～2倍,而ERK2与MKP1的结合力比JNK1弱约6倍;p38α则没有观察到对MKP1去磷酸化能力的激活效果。结论:三种经典MAPKs中,ERK2和JNK1能够激活MKP1催化活力,而p38α则无法激活MKP1,进一步揭示了MAPKs和MKPs间的特异性相互作用,以及底物对MKPs活力的影响。     

TK1与LDH联合检测对非霍奇金淋巴瘤鉴别诊断及疗效评估的作用

目的:探讨联合检测血清胸苷激酶1(TK1)与乳酸脱氢酶(LDH)水平在非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者鉴别诊断及疗效监测中的临床意义。方法:收集2016年1月至2018年6月我院诊治的111例非霍奇金淋巴瘤的初诊患者血清标本,并选择50例正常人血清标本作为对照,采用免疫印迹增强发光法检测TK1浓度,比色法检测LDH浓度。所有患者随访至少1年,分析和比较惰性NHL与侵袭性NHL及各自四类分期之间血清TK1和LDH水平的差异,化疗后完全缓解、部分缓解与未缓解组LDH水平以及NHL患者中血清TK1和LDH的阳性率。结果:高度侵袭性NHL患者和侵袭性NHL患者血清TKI和LDH水平与惰性NHL患者相比显著增高(P0.05),但惰性NHL患者血清TK1和LDH水平与正常组之间差异无统计学意义(P0.05);Ⅲ、Ⅳ期侵袭性NHL患者血清TK1和LDH水平与Ⅰ、Ⅱ期患者相比显著增高(P0.05)。与化疗前相比,四次化疗后,完全缓解组NHL患者血清LDH水平下降21.05%,部分缓解组为16.66%,病情稳定组血清LDH水平升高至11.54%,三组NHL患者血清LDH水平比较差异具有统计学意义(P0.008),两组之间的差异均有统计学意义(P0.05)。结论:联合检测血清TK1和LDH水平对于NHL患者的鉴别诊断、疗效评估均具有重要参考价值。     

PKD1基因与抑癌基因P53多态性与非综合征性唇腭裂的关联研究

目的:探讨多囊性肾病基因1(polystic kidney disease,PKD1)多态位点rs8049367与抑癌基因P53(anti-oncogene P53)多态位点rs4791774单核苷酸多态性与中国北方人群非综合征性唇腭裂(NSCL/P)的相关性。方法:运用聚合酶链式反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)的检测方法,对602例NSCL/P患者和510例对照人群的PKD1基因的rs8049367位点和抑癌基因P53的rs4791774位点进行基因分型。利用SPSS12.0软件分析PKD1基因,抑癌基因P53多态性与NSCL/P的相关性。结果:rs8049367位点和rs4791774位点基因型及基因频率在两组的分布中差异无统计学意义(P0.05)。结论:PKD1基因的rs8049367位点和抑癌基因P53的rs4791774位点单核苷酸多态性可能与中国北方人群非综合征性唇腭裂的发生无相关性。     

普罗布考联合胰激肽原酶对老年糖尿病周围神经病变患者氧化应激反应及血清NSE水平的影响

目的:探讨普罗布考联合胰激肽原酶对老年糖尿病周围神经病变患者氧化应激反应及血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平的影响。方法:选择2015年8月至2017年8月我院接诊的94例老年糖尿病周围神经病变患者作为本研究对象,通过随机数表法将其分为观察组(n=47)和对照组(n=47)。对照组在常规治疗基础上给予胰激肽原酶治疗,观察组在对照组基础上联合普罗布考治疗,两组均连续治疗12周。比较两组治疗后的临床疗效、治疗前后运动传导速度(MNCV)、感觉传导速度(SNCV)、多伦多临床评分系统(TCSS)评分、血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及NSE水平的变化和不良反应的发生情况。结果:治疗后,观察组临床疗效总有效率为93.62%(44/47),明显高于对照组[70.21%(33/47)](P0.05);两组正中神经、腓总神经MNCV、SNCV较治疗前均显著延长(P0.05),且观察组正中神经、腓总神经MNCV、SNCV均明显高于对照组(P0.05);两组TCSS评分各内容和总分、血清MDA、NSE水平较治疗前均显著降低(P0.05),且观察组TCSS评分中症状评分、反射评分、感觉评分和总分及、血清MDA、NSE水平均明显低于对照组(P0.05);两组血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平较治疗前均显著升高(P0.05),且观察组血清SOD、CAT、GSH-Px水平均明显比对照组高(P0.05)。两组治疗期间不良反应总发生率分别为10.64%(5/47)、4.26%(2/47),组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:普罗布考联合胰激肽原酶治疗老年糖尿病周围神经病变患者的效果显著优于单用胰激肽原酶治疗,可更有效改善神经病变程度,其机制可能和缓解氧化应激反应、降低血清NSE水平有关。