伪狂犬病毒UL54蛋白与IRF3互作抑制IFN-β启动子活性

研究伪狂犬病毒UL54蛋白对Ⅰ型干扰素表达的作用及机制,为阐明伪狂犬病毒致病机制提供基础。构建表达UL54的真核质粒,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测UL54对IFN-β及其信号通路分子IRF3和NF-κB启动子活性的影响,并测定UL54对RIGI、TBK1、IRF3和IKKε诱导IFN-β表达的影响;免疫共沉淀方法检测UL54与IRF3的相互作用。构建UL54截短基因表达载体,用双荧光素酶报告基因检测系统和ELISA方法检测UL54截短基因对IFN-β启动子活性的影响。构建了pCDH-UL54和8个UL54截短基因真核表达载体。UL54显著抑制IFN-β和IRF3启动子活性,对RIGI、TBK1、IRF3、IKKe介导的IFN-β有抑制作用,免疫共沉淀方法检测证明其与IRF3存在互作。UL54的1～146aa、74～361aa和84～361aa截短体仍抑制IFN-β启动子活性,但第94aa后的其他截短体基因均丧失该抑制作用。PRV UL54通过与IRF3互作抑制IFN-β启动子活性,UL54第84～94位氨基酸是其抑制IFN-β表达的关键功能区域。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

人β1整合素启动子核心启动序列初步分析

目的:分析人β1整合素在HaCat细胞中核心启动片段.方法:以本室构建的含整合素β1全长启动子1745 bp基因序列(-1745bp～+11 bp)的重组栽体pGL3-1756为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子-845 bp～304bp间基因序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3 basic,构建含正确目的基因重组载体pGL3-542.用pGL3-1756、和pGL3-542质粒转染人表皮细胞株HaCat进行活性分析.结果:酶切及序列测定表明,克隆后插入pGL3 basic中的启动子片段与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确.在人永生化表皮细胞株(HaCat细胞)中构建的pGL3-542载体具有很强的启动活性.结论:成功构建了整合素Bl远端启动子542 bp片段载体,在HaCat细胞中具有非常强的启动活性.人整合素β1整合素启动子核心启动序列可能位于-845 bp～-304 bp.     

小鼠Lrp5基因启动子的克隆及功能分析

为分析小鼠LDL受体相关蛋白 5 (Lrp5 )基因启动子的结构与功能 ,采用DNA重组技术 ,构建了 7种含小鼠Lrp5基因启动子荧光素酶报告基因表达体系 ,分别为 :pGL3 10 3(- 10 3bp～ + 132bp) ,pGL3 30 3(- 30 3bp～ + 132bp) ,pGL3 4 99(- 499bp～ + 132bp) ,pGL3 70 8(- 70 8bp～ + 132bp) ,pGL3 90 9(- 90 9bp～ + 132bp) ,pGL3 10 34(- 10 34bp～ + 132bp ) ,pGL3 12 2 9(- 12 2 9bp～ + 132bp) .以pRL TK为内参照质粒 ,瞬时转染成骨细胞株 (U2OS )及非成骨细胞株 (COS 7) ,收集细胞测定荧光素酶相对表达活性 .7种荧光素酶表达质粒在 2种细胞中表达无显著差异 ,即在所分析的小鼠Lrp5基因的 136 1bp(- 12 2 9bp～ + 132bp)范围内 ,不存在成骨细胞特异的表达元件 ;而且 7种表达质粒在 2种细胞中呈现相似的变化趋势 ,pGL3 10 3表达活性最高 ,pGL3 12 2 9表达活性显著降低 .表明小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列在 - 10 3bp～ + 1bp范围内 ,- 10 34bp～ - 12 2 9bp之间的 195bp片段内可能含有负调控元件 .     

人Tudor-SN基因启动子荧光素酶报告基因表达质粒的构建及活性检测

目的 将人类Tudor-SN基因的启动子序列片段定向连入pGL3-Basic质粒载体,并进行鉴定和启动子活性检测.方法 以HeLa细胞全基因组DNA为模板,PCR法扩增出目的基因,利用XhoⅠ和HindⅢ双酶切法将目的片段连接到pGL3-Basic载体上.再将构建成功的pGL3-Basic-Tudor-SN-promoter重组质粒和内参质粒β-gal瞬时共转染入宫颈癌HeLa细胞,培养48 h后检测萤火虫荧光素酶活性.结果 双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,转染重组质粒后可检测到萤火虫荧光素酶活性.结论 成功构建了人类Tudor-SN基因启动子重组质粒,为Tudor-SN蛋白基因调控机制的研究奠定基础.     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

肌肉LIM蛋白增强生肌素对AChRγ启动子的反式激活作用

采用RT PCR技术克隆了大鼠肌肉LIM蛋白 (MLP) 6 40bp的全长cDNA序列 .以此cDNA为探针进行的Northern印迹表明 ,MLP于C2C12细胞在分化的第 3d至第 5d表达 .将MLPcDNA亚克隆至pcDNA3,构建真核表达质粒pcDNA3 MLP ,同时构建AChRγ启动子序列 (96 0bp)调控的荧光素酶报告基因真核表达质粒pGL3 γ .C2C12细胞转染及荧光素酶活性分析表明 ,复合转染pcD NA3 MLP和pGL3 γ的分化肌细胞表达的荧光素酶活性约为对照的 4倍 ;而在 3T3或未分化肌细胞复合转染pcDNA3 MLP和pGL3 γ均未检出报告基因表达 ,说明MLP可促进生肌素对AChRγ亚基基因启动子的反式激活作用 .     

人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

构建人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体.合成3个连续重复的人β-酪蛋白启动子中干扰素γ活化序列(gamma-activated sequence,GAS)并特其克隆至pGL3-Promoter荧光素酶报告基因载体.测序鉴定构建的载体,然后将其转染人人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts,HELF)中检测荧光素酶的表达活性.测序结果表明,3×GAS序列正确;双报告基因系纯检测荧光素酶活性表明,构建的报告基因具有启动子活性.成功构建的人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体,为进一步研究干扰素γ诱导的JAK-STAT信号通路提供了必要的试验材料.     

关岭牛MyoD玉基因启动子报告质粒的构建及活性验证

为了克隆关岭牛MyoD玉基因启动子并验证其启动活性,根据GenBank中牛的MyoD玉基因序列设计PCR引物,用PCR技术扩增牛MyoD玉基因的启动子,构建重组克隆载体pUCmT-MyoD玉;并通过PCR扩增、限制性酶切、测序及生物信息学分析对阳性克隆进行鉴定;构建报告质粒pGL3-MyoD玉,并将其转染小鼠C2C12、3T3-L1细胞系,检测其24 h后的双荧光素酶活性。实验结果获得了关岭牛MyoD玉基因启动子,其序列长度为993 bp,并成功构建了MyoD玉启动子报告质粒;双荧光素酶活性检测表明pGL3-MyoD玉在小鼠C2C12细胞中的表达是pGL3空载体40.65倍,在小鼠3T3-L1细胞中的表达是空载体的1.13倍,MyoD玉启动子在小鼠C2C12细胞中的表达高于3T3-L1细胞(**p<0.01)。结果表明关岭牛MyoD玉基因启动子具有启动活性,在小鼠骨骼肌细胞中特异性表达。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制I型干扰素信号通路的激活

[目的]研究口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白VP0对I型干扰素信号通路的影响。[方法]通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体（RIG-I-like receptors,RLRs）信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。[结果]成功构建了pCAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4-6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制（P<0.01或P<0.05）;VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达（P<0.01或P<0.05）。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性（P<0.01）,并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。[结论]证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制I型干扰素信号通路的激活。     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

miR-181b-5p 对于卡波西肉瘤细胞SLK细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨Dppa2 基因5'' 端启动子区Oct4 结合位点突变对Dppa2基因启动子活性的影响。方法：PCR 扩增包括Oct4 结合 位点的Dppa2 基因5'' 端转录起始点上游-2439～+293 bp 的启动子序列,片段长度为2732 bp。将该片段连接到pGL3-Basic 载体, 构建野生型pGL3-2439表达载体。采用定点突变法,将-1959～-1957 位碱基的GCA突变成TAG,构建Oct4 结合位点突变型 pGL3-mo2439 表达载体。用上述两种表达载体、PGL3-basic 载体和Oct4 表达载体分别瞬时转染HEK 293 细胞。细胞培养48 h 后,利用双荧光素酶报告系统测定各组细胞表达的荧光素酶的相对活性。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定,证实野生型 (pGL3-2439)和突变型(pGL3-mo2439)载体构建成功。荧光素酶活性测定结果显示,转染Dapp2 基因启动子野生型pGL3-2439 表 达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为16.307,突变型pGL3-mo2439 表达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为10.634。Oct4 结 合位点突变后,Dppa2 基因启动子区转录活性较野生型降低了35 %。结论：Dppa2基因5''端启动子区-1959～-1957 位的Oct4 结 合位点突变可能导致Dppa2 基因启动子活性下降。     

Dppa2 基因启动子区Oct4 结合位点突变对其活性的影响

目的：探讨Dppa2 基因5'' 端启动子区Oct4 结合位点突变对Dppa2基因启动子活性的影响。方法：PCR 扩增包括Oct4 结合 位点的Dppa2 基因5'' 端转录起始点上游-2439～+293 bp 的启动子序列,片段长度为2732 bp。将该片段连接到pGL3-Basic 载体, 构建野生型pGL3-2439表达载体。采用定点突变法,将-1959～-1957 位碱基的GCA突变成TAG,构建Oct4 结合位点突变型 pGL3-mo2439 表达载体。用上述两种表达载体、PGL3-basic 载体和Oct4 表达载体分别瞬时转染HEK 293 细胞。细胞培养48 h 后,利用双荧光素酶报告系统测定各组细胞表达的荧光素酶的相对活性。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定,证实野生型 (pGL3-2439)和突变型(pGL3-mo2439)载体构建成功。荧光素酶活性测定结果显示,转染Dapp2 基因启动子野生型pGL3-2439 表 达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为16.307,突变型pGL3-mo2439 表达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为10.634。Oct4 结 合位点突变后,Dppa2 基因启动子区转录活性较野生型降低了35 %。结论：Dppa2基因5''端启动子区-1959～-1957 位的Oct4 结 合位点突变可能导致Dppa2 基因启动子活性下降     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因形插入质粒pGL3-hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hWp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有形mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达,提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件．     

小鼠TIE2基因启动子的克隆及转录活性分析

克隆小鼠TIE2基因的启动子并分析其转录活性.设计并合成引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,巢式PCR扩增小鼠TIE2基因启动子区.将扩增获得的系列截短片段克隆入荧光素酶(Luc)报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建系列启动子区转录活性报告质粒pGL3-TIE2-Luc.报告质粒与内参质粒共转染SVEC4-10、NIH3T3、HUVEC及NIT-1细胞系,48h后收获细胞检测双荧光素酶的表达情况.构建的pGL3-TIE2-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确;转染4种细胞系后进行双荧光素酶活性检测的结果表明,TIE2基因启动子区域(-2056-+1)具有较强的转录活性.成功构建小鼠TIE2基因启动子报告质粒,证实TIE2基因上游区域(-2056-+1)具有较强的启动子活性.     

SARS—CoVSars7a和EGFP融合蛋白真核表达载体构建及其表达

根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于．EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体。采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a—EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白。此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活

【目的】研究口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP0对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。【结果】成功构建了p CAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4–6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制(P0.01或P0.05);VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达(P0.01或P0.05)。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性(P0.01),并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。【结论】证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。     

干扰素γ增强GH3细胞中人生长激素基因表达机制

为了研究干扰素γ(IFN γ)对大鼠垂体GH3细胞中人生长激素 (hGH)基因启动子活性的影响及其可能的作用机制 ,采用荧光素酶报告基因方法 ,将含hGH基因启动子 (- 4 84～ 2bp)和荧光素酶报告基因的表达质粒pGL3 4 84 Luc单独转染或与垂体特异性核转录因子Pit 1蛋白表达质粒 (pcDNA Pit 1 cDNA)或Pit 1反义寡核苷酸 (Pit 1OND)共转染于大鼠垂体GH3细胞中 ,观察加入IFN γ及细胞内信号转导途径的抑制剂后GH3细胞中荧光素酶表达的变化 ,反映其对hGH启动子活性的影响 ;将含不同长度hGH基因启动子序列的荧光素酶表达质粒pGL3 3 80 Luc(- 3 80～ 2bp)、pGL3 2 5 0 Luc(- 2 5 0～ 2bp)、pGL3 1 3 2 Luc(- 1 3 2～ 2bp)和 pGL3 6 6 Luc(- 6 6～2bp)分别转染GH3细胞 ,观察它们对IFN γ的反应 ,以寻找IFN γ影响hGH基因启动子活性的关键序列。结果表明 ,IFN γ (1 0 5u/L ,1 0 6u/L)均能促进大鼠垂体GH3细胞中荧光素酶的表达 ,最高达对照组的 1 3 1 % (P <0 .0 0 1 ) ;在胞内信号转导抑制剂中 ,只有丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号转导途径抑制剂PD980 5 9(4 0 μmol/L) ,能完全阻断IFN γ的促进作用 ;Pit 1蛋白过表达和表达被抑制对IFN γ的促进作用没有影响 ;含不同长度hGH基因启动子序列质粒中 ,只有 pGL3 3 8     

SARS-CoV Sars7a和EGFP融合蛋白真核表达载体构建及其表达

根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体.采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a-EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白.此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响.