用基因芯片结合荧光差异显示—PCR筛选和识别胃腺癌转移相关的基因

使用来源于同一个胃腺癌病人的原发灶RF－1（ATCC编号：CRL－1864）和转移灶RF－48细胞系（ATCC编号,CRL－1863）作为研究肿瘤转移分子机制的模型,RF－1（实验组）和RF－48（对照组）的mRNA通过逆转录方法,将Cy3和Cy5两种荧光染料分别标记到两种细胞的cDNA上,制备成cDNA探针,并与表达谱芯片（双点4096条基因）进行杂交与扫描,重复2次实验,利用计算机数据处理判断基因是否在上述两种细胞中有表达差异,共筛选出差异表达的基因共138条,其中81条在RF－48细胞中表达明显上调,57条在RF－48细胞中表达显著下调,同时也通过荧光差异显示－PCR（FDD－PCR）技术,克服了45个涉及胃腺癌转移相关基因,包括未被发现的基因3个,在两种筛选方法中都存在差异表达的基因共有7条,对部分可能与肿瘤志移机制有关的差异表达基因的作用进行了分析和讨论,基因芯片技术可高通量,大规模地研究基因表达水平,FDD－PCR技术可克隆出未发现的新基因,二者结合,初步筛选出与转移相关的基因,有助于揭示胃腺癌转移的分子机制。     

增强P18~(INK4C)表达对胃腺癌细胞侵袭的影响(英文)

在应用基因芯片技术筛选胃腺癌转移相关基因的过程中 ,发现CDK抑制因子P18INK4C在人类胃腺癌转移细胞株RF 4 8中的表达较其原发灶细胞株RF 1明显下调 .这提示P18INK4C表达差异与胃腺癌细胞的侵袭转移可能有一定程度的相关性 .通过构建P18INK4C 表达质粒并将其转染入RF 4 8增强P18INK4C的表达 ,研究其对胃腺癌原发灶细胞体外运动、侵袭转移能力以及生长特性的影响 ,进一步明确P18INK4C与人类胃腺癌侵袭转移之间的关系 .结果发现 ,增强P18INK4C表达可以使胃腺癌原发灶细胞的体外侵袭能力明显下降 ,而对RF 4 8的细胞周期和生长增殖能并力未产生影响 .上述结果提示 ,P18INK4C参与人类胃腺癌转移过程 ,在此过程中其主要的作用可能并不是调节细胞周期 ,而是与胃腺癌原发灶细胞侵袭转移能力的调节密切相关 .     

抑制P18^INK4C表达对胃腺癌细胞侵袭的影响

应用基因芯片技术筛选胃腺癌转移相关基因的过程中 ,发现CDK抑制因子 (CKI)P18INK4C在人类胃腺癌转移细胞株RF 4 8中的表达 ,较其原发灶细胞株RF 1明显下调。这提示 ,P18INK4C表达差异与胃腺癌细胞的侵袭转移 ,可能有一定程度的相关性。为此 ,通过反义RNA技术抑制在RF 1中的表达 ,研究其对胃腺癌原发灶细胞体外运动、侵袭转移能力以及生长特性的影响 ,进一步明确P18INK4C与人类胃腺癌侵袭转移之间的关系。结果发现 ,抑制P18INK4C的表达 ,可以使胃腺癌原发灶细胞的体外侵袭能力明显增加 ,抑制前RF 1细胞的体外侵袭能力仅为抑制后的 4 4 %。然而 ,RF 1的细胞周期和生长增殖能力 ,并未因为P18INK4C表达的改变而受到影响。上述结果提示 ,P18INK4C参与人类胃腺癌转移过程 ;在此过程中 ,其主要的作用可能并不是调节细胞周期 ,而是与胃腺癌原发灶细胞侵袭转移能力的调节密切相关。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

小麦PAL基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析

利用苯丙氨酸解氨酶(PAL,phenylalanine ammonia-lyase)基因保守区域从小麦抗赤霉病材料苏麦3号中克隆获得4个PAL基因,分别命名为Ta PAL1、Ta PAL2、Ta PAL3、Ta PAL4。4个基因的开放阅读框(ORF,open reading frame)长度分别为2142 bp、2016 bp、2118 bp和2139 bp,分别编码714个、672个、706个和713个氨基酸。基因序列比对发现其相似性达到88.35%,所编码的氨基酸相似性为91.92%,氨基酸序列分析表明4个基因都包含HAL-PAL结构域及PAL结构域。通过接种禾谷镰刀菌,利用荧光定量PCR对PAL基因进行表达分析发现,4个PAL基因全部为上调表达,其中Ta PAL2、Ta PAL3和Ta PAL4最为明显。PAL基因的上调表达,说明PAL基因在小麦抵抗赤霉病菌侵染的机制中可能起着重要作用。     

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术首次从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT1(GenBank登录号为FJ848871).研究结果表明:GhCCoAOMT1基因cDNA全长960 bp,具有一个753 bp的开放阅读框,5'非编码区为9 bp,3'非编码区为198 bp,编码250个氨基酸,预测分子量约为28.306 kDa,等电点为5.39.利用PCR方法克隆了GhCCoAOMT1基因的基因组序列,长度为1 311 bp,包含5个外显子和4个内含子.氨基酸同源性分析发现,GhCCoAOMT1与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,GhCCoAOMT1基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高,其次表达量依次为根>花瓣>子叶>10 d纤维>雄蕊>胚珠>叶.     

梭梭肌动蛋白基因HaACT1全长的克隆与表达分析

根据本实验已克隆得到的梭梭肌动蛋白基因Ha ACT1部分序列,通过5'RACE技术获得HaA CT1的cDNA全长序列。序列分析表明,该基因c DNA全长序列1 534 bp,其中5'UTR序列为75 bp,3'UTR序列为325 bp,开放阅读框序列为1 134 bp,编码376个氨基酸。该序列与Gen Bank中收录的其它植物Actin基因核苷酸序列的相似性均在84%以上,并且它们的氨基酸序列的相似性达95%以上,Gen Bank登录号为KM886609。根据得到的c DNA序列设计全长引物,进一步克隆了Ha ACT1的基因组DNA序列,由4个外显子和3个内含子组成。利用半定量和绝对荧光定量PCR对Ha ACT1的表达进行分析,发现该基因在梭梭的不同组织及各种非生物胁迫下均能稳定表达,适合作为梭梭中其它功能基因表达研究中的内参基因。     

鳜鱼胰蛋白酶和淀粉酶与胃蛋白酶原基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法,克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)肝胰脏胰蛋白酶(trypsin, Try)、淀粉酶(amylase, Amy)基因 cDNA全序列.结果表明,鳜鱼Try基因cDNA全长为896 bp,其中开放阅读框 (open reading frame,ORF)为744 bp,编码247个氨基酸. 序列同源性分析发现,鳜鱼Try与 斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、 小鼠Try和人TRY氨基酸序列同源性分别为81.4%、75.3%、74.5%和71.4%.鳜鱼Amy 基因cDNA全长为1 647 bp,其中ORF为1 539 bp,编码512个氨基酸.鳜鱼Amy与斑马鱼 、非洲爪蟾、小鼠Amy和人AMY氨基酸序列同源性分别为79.7%、75.4%、71.9%和70.9%. 同时对鳜鱼基因组进行PCR,获得鳜鱼Try、Amy与胃蛋白酶原(pepsinogen, Pep)全基因组DNA序列.序列分析表明,鳜鱼Try基因由4个内含子和5个外显子组成,全长1 362 bp;鳜鱼Amy基因由8个内含子和9个外显子组成,全长4 267 bp;鳜鱼Pep基因由8个内含子和9个外显子组成,全长 4 032 bp,与其它脊椎动物基因结构相似.应用Genome walker方法在鳜鱼克隆得到长度分别为1 189 bp、413 bp和527 bp的Try、Amy和Pep基因的5′侧翼区序列以及1段长为704 bp的Pep 基因3′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个可调节其表达的调控元件.鳜鱼Try、Am y和Pep基因组全序列的克隆及其序列、结构分析和分子系统进化等的研究,为鱼类消化代谢相关基因的生理功能及表达调控机理进一步研究提供依据.     

荧光假单胞菌香兰素脱氢酶基因的克隆及表达

对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens ATCC13525)香兰素脱氢酶基因vdh进行了克隆、序列分析以及表达。PCR扩增获得了长度为1 449 bp的核苷酸序列,该序列编码含438个氨基酸,分子量约为50 ku的多肽。序列分析表明该基因与GenBank提供的部分已知vdh基因具有高度的同源性。该基因在大肠杆菌DH5α中能高效表达,而在野生型P.fluorescens ATCC13525中本身并不表达出功能。Vdh基因表达产物香兰素脱氢酶(Vdh)在细胞中主要以可溶性蛋白的形式存在。同时研究表明诱导剂IPTG对vdh基因在大肠杆菌中的表达并不起作用。     

产植酸酶菌株的筛选及其植酸酶基因的克隆

从土壤中筛选到产植酸酶活性较高的烟曲霉菌株WY-2,其植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃。通过对烟曲霉WY-2植酸酶基因进行PCR扩增,获得了一个1.5kb大小的特异性产物,将其克隆到载体pMD18-T中。测序结果分析表明,该基因片段含有植酸酶基因完整的阅读框架(ORF),基因全长1459bp,其中包含一个61bp的内含子,编码465个氨基酸,有7个潜在的糖基化位点,5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。该基因与已报道的烟曲霉ATCC34625植酸酶基因有91%同源性,编码的氨基酸序列同源性为91%。     

细胞周期蛋白E2基因的过度表达与胃腺癌细胞迁徙的关系

从基因芯片筛选出差异表达的基因中一个细胞周期蛋白 (cyclin)E2基因 ,深入研究周期蛋白E2在高转移性胃腺癌细胞系RF 4 8细胞中的生物学作用 .首先通过合成硫代磷酸化修饰的反义、正义和错配寡核苷酸片段 ,使用半定量RT PCR和Western印迹方法分别检测被 3种寡核苷酸转染的RF 4 8细胞在 1～ 5d内周期蛋白E2基因及它可能调控下游靶基因之一FGFR基因和蛋白质的表达 ,检测寡核苷酸转染的RF 4 8细胞周期和凋亡细胞 ,观察寡核苷酸转染RF 4 8细胞的软琼脂集落形成、运动能力和体外侵袭能力 .结果表明 ,修饰的反义寡核苷酸在有效地抑制RF 4 8细胞中周期蛋白E2表达上调后 ,RF 4 8细胞的迁徙能力被显著降低 ,其增殖、运动能力没有变化 .周期蛋白E2基因的主要作用并不是促细胞分裂 ,也与细胞的增殖、运动能力无关 ,周期蛋白E2基因的过度表达与胃腺癌的迁徙性存在相关性 ,其触发肿瘤的侵袭性可能通过某种机制调控其下游靶基因之一成纤维细胞生长因子受体 (FGFR)基因的表达来实现的     

Identification of differentially expressed genes in isogenic highly metastatic and poorly metastatic cell lines of R3230AC rat mammary adenocarcinoma

Tumour metastasis occurs as a result of a cascade of events including alterations in the expression of various genes. The identification of such genes is essential to understanding formation of metastasis. In a previous study, highly metastatic (LN4.D6) and poorly metastatic (CAb.D5) cell lines were obtained from the rat mammary adenocarcinoma cell line R3230AC. Subtractive hybridization was used to identify differentially expressed genes between these two cell lines. We identified eight cDNA clones in CAb.D5 and six cDNA clones in LN4.D6 that were differentially expressed. One of the cDNA clones in each cell line had no homology with known sequences. Expression patterns of these differentially expressed genes were examined in a pair of rat mammary and prostate adenocarcinoma cell lines. Compared with cell lines examined, cDNA FF-10 was only expressed in CAb.D5; however, cDNA RB-8, RE-1, RF-5 were only expressed in the highly metastatic LN4.D6. No correlation was observed between expression patterns of the differentially expressed genes and metastatic potential of these cells. However, differential expression of genes, especially cytokeratins (CK8 and CK5) and collagens (III and IV) between highly metastatic and low metastatic rat mammary adenocarcinoma cell lines might initiate further investigation of these genes in metastatic process.     

Human MUC4 mucin cDNA and its variants in pancreatic carcinoma

The human MUC4 gene is not expressed in normal pancreas; however, its dysregulation results in high levels of expression in pancreatic tumors. To investigate the tumor-associated expression, MUC4 cDNA was cloned from a human pancreatic tumor cell line cDNA expression library using a polyclonal antibody raised against human deglycosylated mucin and RT-PCR. Pancreatic MUC4 cDNA shows differences in 12 amino acid residues in the non-tandem repeat coding region with no structural rearrangement as compared with tracheal MUC4. The full-length MUC4 cDNA includes a leader sequence, a serine and threonine rich non-tandem repeat region, a central large tandem repeat domain containing 48 bp repetitive units, regions rich in potential N-glycosylation sites, two cysteine-rich domains, EGF-like domains, and a transmembrane domain. We also report the presence of a new EGF-like domain in MUC4 cDNA, located in the cysteine-rich region upstream from the first EGF-like domain. Four distinct splice events were identified in the region downstream of the central tandem repeat domain that generate three new MUC4 cDNA sequences (sv4, sv9, and sv10). The deduced amino acid sequences of two of these variants lack the transmembrane domain. Furthermore, two unique forms of MUC4 (MUC4/Y and MUC4/X) generated as a result of alternative splicing lack the salient feature of mucins, the tandem repeat domain. A high degree of polymorphism in the central tandem repeat region of MUC4 was observed in various pancreatic adenocarcinoma cell lines, with allele sizes ranging from 23.5 to 10.0 kb. MUC4 mRNA expression was higher in differentiated cell lines, with no detectable expression in poorly differentiated pancreatic tumor cell lines.