4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS—CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至Teasy vector。扩增片段的序列测定结果表明：所分离的4株SARS—CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游—197nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

黄热病毒的一步RT-PCR法检测

自不同稀释度的乳鼠脑病毒悬液中制备总RNA,在自制缓冲液条件下,进行一步RT-PCR法检测。对一步RT-PCR法与常规RT-PCR的敏感性进行比较,并且以基孔肯亚病毒和登革1-4型病毒RNA为模板进行特异性观察。结果表明,本研究建立的一步RT-PCR法可检出2.8×10~3PFU的病毒,敏感性比常规RT-PCR法高10倍,且与基孔肯亚病毒、登革病毒1-4型无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性,适用于黄热病毒的病原学检测。     

2006年广州登革热病原体的分离鉴定及其生物学性质的观察

目的：对2006年广州流行登革热病原进行分离鉴定及生物学性质研究。方法：采用传代蚊细胞微量培养方法对2006年广州登革热病原进行分离,并通过脑内途径观察其对乳鼠的致病性;经间接免疫荧光和RT-PCR技术,对患者血清标本中的病毒特异抗体及新分离的病原体进行检测和鉴定;将此次分离的病原体与1980年分离的同型毒株进行生物学性质比较。结果：从57份患者血清标本中分离出10株病毒,在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并对乳鼠致病;其基因组为登革1型病毒特异的RNA分子,经鉴定为登革1型病毒;此次分离的登革1型病毒与1980年分离的同型毒株在致细胞产生病变的时间和严重程度,蚀斑的大小、形态以及致乳鼠发病的时间等生物学性质上有所不同。结论：2006年广州流行登革热病原为登革1型病毒,且与1980年分离的同型毒株在生物学性质方面存在明显差异。     

RIG-I样受体与RNA病毒识别

RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLR)是一类新发现的模式识别受体,能够识别细胞质中的病毒RNA,通过RLR级联信号诱导干扰素和促炎症细胞因子的产生,对抗病毒天然免疫的建立起着非常重要的作用.RLR信号通路既受宿主的严格调控,也能够作为病毒逃避宿主干扰素反应的靶点.本文重点讨论了RLR及其在RNA病毒识别和抗病毒天然免疫中的作用.     

siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用

为探讨siRNA在哺乳动物细胞中对SARS冠状病毒复制的抑制作用,针对BJ0 1株SARS冠状病毒复制酶基因(Pol)和刺突蛋白基因(S) ,设计4个siRNA ,并构建相应的siRNA表达载体及克隆细胞系.利用间接免疫荧光法及实时定量反转录PCR法,检测所设计的siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用.结果表明,针对Pol基因的siRNA(psOe)在Vero细胞中可阻断BJ0 1株SARS病毒RNA的复制及其蛋白的表达.该结果为深入阐明SARS冠状病毒的致病机理及探讨SARS病毒防治新途径奠定了基础.     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.     

SARS-CoV 中国株基因组全长cDNA的构建及其恢复病毒的生物学性质

严重急性呼吸综合征是SARS_CoV引起的一种重要新发传染病,其致病机制的研究对于防治该病十分必要。为了利用反向遗传学技术研究SARS_CoV的致病机制,将覆盖SARS_CoV BJ01株基因组全长的7个cDNA片段纯化后进行体外连接,构建基因组全长cDNA分子,以其为模板,使用 T7 RNA 聚合酶系统在体外进行转录, 获得病毒RNA。用电穿孔转染法将转录体RNA导入Vero E6细胞,可观察到典型的SARS_CoV致细胞病变作用。对收获的恢复病毒采用 RT_PCR方法进行鉴定,结果表明获得的恢复病毒与SARS_CoV BJ01株原病毒序列一致。以针对SARS_CoV的抗体对感染细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有特异感染性的恢复病毒。同时用细胞病变法和空斑试验测定了恢复病毒及其亲本毒株的病毒滴度, 结果表明二者在致病性上没有明显差异,恢复病毒具有与原型株相似的生物学特性。SARS_CoV BJ01株基因组全长cDNA的成功构建及对恢复病毒生物学性质的研究将为进一步探索SARS_CoV致病的分子机制及研制新型疫苗奠定良好的基础。     

西尼罗病毒的RT-PCR检测与鉴定

建立西尼罗病毒敏感、特异、快速的RT-PCR检测方法用于实验室诊断和流行病学监测。采用一步RT-PCR和套式PCR法对西尼罗病毒感染的乳鼠脑和细胞培养上清进行扩增,并对扩增产物进行序列测定。两种方法均可分别从两种组织中扩增出与预期大小相一致的片段,套式PCR法比一步RT-PCR法更为敏感,该扩增片段与西尼罗病毒埃及Eg101株相应序列的同源性为99％。     

登革病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及应用

根据登革 2型病毒衣壳蛋白C基因和葡萄球菌核酸酶SN基因序列设计引物 ,从构建的原核表达载体pLEX D2C SN中扩增获得编码登革病毒衣壳蛋白和葡萄球菌核酸酶的融合基因D2C SN ,将其插入到真核表达载体pcDNA6 V5 His中 ,筛选获得重组质粒pcDNA D2C SN .电穿孔转染BHK细胞后 ,5mg Lblasticidin压力筛选 ,通过RT PCR、间接免疫荧光和免疫印迹鉴定表达的蛋白 ,体外DNA消化试验检测核酸酶活性 .结果表明 ,融合蛋白D2C SN在BHK细胞中获得了稳定表达 ,表达的融合蛋白能够被抗登革病毒衣壳蛋白的单克隆抗体特异识别 ,并具有良好的核酸酶活性 ,能够对DNA进行切割 .同时 ,BHK细胞中稳定表达的融合蛋白D2C SN能够有效抑制登革病毒的增殖 ,使其感染性降低 10 3 ～ 10 4倍 .这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于人类抗登革病毒感染奠定了基础