SARS-CoV 中国株基因组全长cDNA的构建及其恢复病毒的生物学性质

严重急性呼吸综合征是SARS-CoV引起的一种重要新发传染病,其致病机制的研究对于防治该病十分必要。为了利用反向遗传学技术研究SARS-CoV的致病机制,将覆盖SARS-CoVBJ01株基因组全长的7个cDNA片段纯化后进行体外连接,构建基因组全长cDNA分子,以其为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,获得病毒RNA。用电穿孔转染法将转录体RNA导入VeroE6细胞,可观察到典型的SARS-CoV致细胞病变作用。对收获的恢复病毒采用RT-PCR方法进行鉴定,结果表明获得的恢复病毒与SARS-CoVBJ01株原病毒序列一致。以针对SARS-CoV的抗体对感染细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有特异感染性的恢复病毒。同时用细胞病变法和空斑试验测定了恢复病毒及其亲本毒株的病毒滴度,结果表明二者在致病性上没有明显差异,恢复病毒具有与原型株相似的生物学特性。SARS-CoVBJ01株基因组全长cDNA的成功构建及对恢复病毒生物学性质的研究将为进一步探索SARS-CoV致病的分子机制及研制新型疫苗奠定良好的基础。     

昆津病毒复制子——一种新型病毒载体

病毒复制子 (Replicon) 是指来源于病毒基因组的能够自主复制的RNA分子,保留了病毒非结构蛋白基因,而结构蛋白基因缺失或由外源基因替代。昆津病毒 (Kunjun virus) 为黄病毒科黄病毒属成员,其复制子具有表达效率高、细胞毒性低、遗传稳定等特点,在病毒基因组复制调控机制、外源蛋白表达、新型疫苗和基因治疗等领域得到了广泛应用。以下就昆津病毒复制子系统的构建、特性及应用方面的研究进展作一综述。     

重症手足口病免疫球蛋白治疗的机理探讨

手足口病是由多种肠道病毒感染导致的一种急性儿科传染病.近年来,我国肠道病毒71型(EV71)手足口病发病率急剧上升,重症病例时有报道,严重威胁儿童健康.临床上对于重症手足口病的治疗缺乏有效手段,主要以对症治疗和支持疗法为主.静脉注射人免疫球蛋白由健康献血员血浆提取纯化而来,含有包括EV71在内的多种肠道病毒的中扣抗体,可作为重症手足口病被动免疫和免疫调节的重要手段,值得关注.     

登革2型病毒43株prM基因片段在痘苗中的克隆与表达

利用RT-PCR技术获得登革2型病毒中国分离株(D_2-43)的prM基因片段。扩增产物经酚:氯仿抽提纯化之后,直接插入pT_7BlueT载体中,经DNA序列分析证明了所扩增片段序列的正确性。构建了痘苗病毒载体PJSA1175/prM,外源基因受痘苗病毒启动子P_(7.5K)的调控。脂质转染(Lipofection)法获得D_2-43株prM蛋白的重组病毒。荧光检测显示,重组痘苗病毒表达的prM蛋白分布于细胞表面。间接ELISA测定其滴度为1:4。     

SINDBIS病毒结构蛋白的肽图

采用双向肽图法对Sindbis病毒糖蛋白(E_1和E_2)及衣壳蛋白(C)的寡肽进行了分析。首先,用不连续的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对该病毒的三种结构蛋白进行分离,经考马斯蓝染色定位后,分别切取蛋白带。然后,按改良的氯氨T法用~(125)I直接标记胶条中的蛋白质;~(125)I标记的蛋白经TPCK-胰酶消化后,在硅胶板上进行电泳和层析。结果表明,三种结构蛋白的肽图是不同的。但两种糖蛋白分子E_1和E_2具有某些类似之处,因此,它们可能含有一些共同的顺序;与衣壳蛋白C相比则截然不同。说明Sindbis病毒的结构蛋白E_1、E_2和C具有不同的氨基酸排列顺序。     

Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的转基因小鼠。方法:用分子克隆的方法构建包括肺表面活性蛋白A(SP-A)启动子、SARS-CoVN蛋白基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和人生长激素(hGH)polyA的转基因载体pSP-A-N。以显微注射的方法将8.3kb的转基因片段引入小鼠受精卵。通过PCR、Southern印迹和LacZ染色检测子代小鼠中转基因的整合及表达。结果:共注射952枚受精卵,移植至42只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠128只,经PCR、Southern印迹鉴定,其中11只小鼠基因组上整合有SARS-CoVN蛋白基因,整合率为8.6%。鉴定结果显示,11只转基因首建者小鼠中有1只表达外源基因并能正常传代。LacZ染色结果表明N蛋白基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中特异表达。结论:成功构建了Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS-CoVN蛋白的转基因小鼠,为深入研究该基因的病理生理学效应奠定了基础。     

PCR-RFLP技术用于中国登革2型病毒株基因型快速分型

利用RT-PCR的方法,对中国5株登革2型病毒的prM-E基因进行扩增,选择合适的限制性内切酶将扩增产物特异地切割成若干长度不同的片段,经5％聚丙烯酰胺凝胶电泳后,对获得的银染带型进行分析。结果表明FJ-10株和FJ-11株属同一基因型,D2-43株和D2-44株属同一基因型,D2-04株与上述4株基因型不同,这与核苷酸测序分析结果完全一致。在此基础上建立PCR-RFLP技术用于登革2型病毒基因型快速分型,具有省时、操作简单、不需使用同位素等特点,为登革热疫区实验室和临床诊断提供了一种快速有效的分子生物学方法。     

三种中药处方对SARS相关冠状病毒体外抑制作用的初步研究

探讨三种中药处方对Vero—E6细胞内SARS相关冠状病毒的抑制作用。取一定量的SARS相关冠状病毒BJ01株加入培养好的Vero—E,6细胞中,置37℃、5％CO2孵箱吸附2h,吸出病毒液。再分别加入不同浓度的药物稀释液,在同样条件下培养48-72h,观察细胞病变情况。迪康注射液、连花清瘟胶囊和复方连蒲颗粒抑制Vero—E6细胞内SAILS—CoV的半数有效浓度(EC50分别为0．056、0．11和0．49mg／ml,治疗指数（TT）分别为53．6、40．3和4．0。说明上述三种中药处方在体外对SAILS—CoV有一定抑制作用。     

登革疫苗研究进展

登革病毒是一种危害较严重的病原体,在世界范围内的流行颇为频繁,然而目前仍设有安全有效的疫苗。近年来,人们对传统疫苗（灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗）及新型疫苗（cDNA疫苗、嵌合体疫苗和DNA疫苗）的研究已取得了一定的成果。本文就这方面的进展作一综述。     

登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究

将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后将转染的宿主细胞用登革 2型病毒株攻击 ,并分别观察含正、反义PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒效果。通过碱基序列测定 ,筛选出含PrM基因正、反向插入的pSFV PrM重组质粒。并获得了经重组RNA与辅助RNA共转染细胞而产生的重组病毒颗粒。含有反义PrM基因的重组病毒RNA ,在宿主细胞中具有抗登革 2型病毒复制的作用 ,而且强于含正义PrM基因的重组病毒RNA。