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报道重组点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(简称apPEP)的基因工程下游工艺研究。工程菌株E.coli BL21/pKKH\|PEP表达产物apPEP为可溶性蛋白,在NBS BioFlo 3000型5L自控发酵罐中经14h培养每升发酵液可达到22.5g干重菌体,含apPEP 3.0g左右。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经Sephadex G-25、High performance Q sepharose FF(HP\|Q)、Phenyl separose 6 FF柱层析分离纯化,每升发酵产物最终可得0.86g纯度达96%的重组apPEP,比活力达到65.5u/mg,整个纯化工艺的蛋白回收率为8.2%,活力回收率为24.4%。纯化的apPEP经电喷雾质谱测定分子量为76464±30D,N端氨基酸序列与基因序列推导的一致。等电点为pI6.0左右。与Aeromonas hydrophila来源的PEP(pI=5.5)相近。 相似文献
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王德宝 《Acta biochimica et biophysica Sinica》1997,29(4):327-329
tmRNA王德宝(中国科学院上海生物化学研究所,上海200031)早在本世纪六十年代初期,就知道蛋白质的生物合成和三类RNA有关。它们是tR-NA,mRNA和核糖体的rRNA。DNA的蛋白质基因要先转录成mRNA,然后在核糖体上,mRNA的密码子和带... 相似文献
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对酵母NMT基因在大肠杆菌中表达进行较详细的研究,进而构建了复制子为p15A并含卡那霉素抗性基因的相容性表达质粒pKZMT,将其与表达质粒pCZmCα1共转化进大肠杆菌BL21(DE3)F′,进行双质粒表达偶联加工修饰研究,其中pCZmCα1表达底物蛋白小鼠cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基α(PKA-mCα)。SDSPAGE及Westernblot分析表明,双质粒表达系统中,PKA-mCα都得到了稳定的高表达,尤其在23℃低温诱导表达时,表达产物的可溶性部分明显增多;而酵母NMT被控制在有利于活性功能的可溶性低水平表达。[3H]myristicacid标记测定及放射自显影的结果显示,在大肠杆菌中表达的重组PKA-mCα被豆蔻酰化修饰。 相似文献
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特异亲和活性蓝染料的小分子RNA的SELEX筛选 总被引:5,自引:1,他引:4
化学合成含有20 个核苷酸随机序列, 长度为73 个核苷酸的单链 D N A 随机库; P C R 扩增和双链化后, T7 R N A 聚合酶体外转录得到单链 R N A 随机库。以活性蓝染料凝胶柱为筛选介质, 体外进化方法筛选特异亲和活性蓝染料的 R N A 分子。经8 轮循环筛选, R N A 群体亲和染料的比例从小于0 .03 % 上升至22 .4 % 。克隆筛选出 R N A 序列后, 测定了30 个克隆的序列, 得到三类 R N A 分子。经二级结构分析和活性蓝染料特异亲和能力测试,发现 R N A 特异亲和活性蓝染料的主要结构因素是 R N A 形成的双链结构 相似文献
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利用细小RNA 病毒属脑炎和心肌炎病毒(EMCV)的内核糖体进入位点(IRES)元件构建了人肿瘤坏死因子受体75 基因(hTR75) 和新霉素抗性基因(neoR)的双顺反子表达载体, 通过电脉冲转染BHK21 细胞, 筛选出分别和同时稳定过量表达两种hTNF受体的细胞株。这些细胞在mRNA 和蛋白质水平均可检测到hTR75 的表达。利用野生型和具有两种受体选择性结合活性的hTNFα突变体对这些细胞株进行测定, 发现过量表达的hTR75 可以独立地介导hTNFα对BHK21 细胞的细胞毒性, 而hTR55 的存在并不能显著增强这种作用。上述结果为进一步阐明TR75 的功能以及两种受体间的相互作用提供了一条新的途径。 相似文献
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王德宝教授治丧委员会 《中国生物化学与分子生物学报》2002,18(6):1-1
中国共产党党员、九三学社社员、著名生物化学家、中国科学院院士、中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员 ,全国第四、五届人大代表 ,全国第六、七届政协委员 ,中国科学院学部前主席团成员王德宝教授 ,因病医治无效 ,于 2 0 0 2年 11月 1日在上海逝世 ,享年 84岁。王德宝教授是一位杰出的科学家 ,是我国在世界上首次人工全合成酵母丙氨酸转移核糖核酸研究工作具体的业务领导者 ,这项成果是我国继在世界上首次人工全合成结晶牛胰岛素后 ,在生命科学史上竖起的又一座里程碑。王德宝教授热爱祖国 ,淡泊名利 ,知识渊博… 相似文献
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(一)核糖体RNA拓扑学研究的重要性核糖体是细胞合成蛋白质的唯一场所。核糖体包括两个亚基,由RNA和蛋白质组成,蛋白质占1/3,而RNA占2/3,即RNA是主要组分。蛋白质生物合成的大多数步骤,包括肽链合成的起始、延伸和终止都是在核糖体上进行的。整个合成过程涉及二百多种生物大分子的协同作用。在蛋白质生物合成中,重要的是肽键的形成。这一化学反应就是在核糖体上进行的。核糖体的任何个别组分或局部组分都不能催化肽键的形成,而必须是完整的核糖体,因此人们认为核糖体本身就是一个包括多种蛋白质和rRNA的复杂酶系(有人把核糖体看作 相似文献
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大鼠甘氨肽酰化单氧酶基因的克隆与表达 总被引:1,自引:0,他引:1
本文采用原位杂交及PCR方法,从大鼠脑cDNA库中,筛选到3个大鼠甘氨肽酰化单氧酶(rPAM)基因片段。经DNA全序列分析表明,它们跨越rPAM-2全部编码区。通过点突变、PCR重组技术等,分别拼接出此双功能酶的rPHM(氧化酶)、rPAL(裂解酶)及其rPAM全酶基因,并构建了多种大肠杆菌表达质粒。经温敏诱导。高效表达了rPAM-N260片段,并制各获得阳性抗血清,可用于免疫检测天然或重组的PAM。而SDS-PAGE和Westernblot分析结果显示,rPHM和rPAM在大肠杆菌中均获得了表达,其中rPHM表达量占全菌总蛋白的10%以上。进一步研究还发现,通过采用低温和加二价铜离子诱导表达,可提高rPHM产物的可溶性及稳定性。 相似文献