雌激素通过LRP16基因5′侧翼GC富含区上调其转录的分子机制

LRP16是一个明确的雌激素(E2)反应性靶基因,已往研究在LRP16基因上游调控区鉴定了一个E2反应性1/2ERE/GC富含的ERα作用位点（-676 bp到-214 bp;命名为A区）.为进一步鉴定雌激素上调LRP16基因表达的最大化反应区域,对LRP16基因上游调控区进行缺失突变,通过相对荧光素酶活性分析观察到LRP16基因的一段5′近端侧翼序列（-213 bp到-24 bp;命名为B区）具有明显的E2反应性.通过与A区比较,认为B区最大化的呈递了E2对LRP16基因的转激活效应.序列分析表明,B区缺乏经典的ERE元件,而包含多个富含GC序列.针对Sp1的siRNA实验结果提示,Sp1参与了E2对该区域的转激活.针对GC富含区进一步的缺失突变,及荧光素酶活性分析,识别了一段30 bp（-213 bp到-184 bp）的序列在B区呈递E2反应活性中发挥核心作用.超级凝胶电泳实验结果表明,Sp1蛋白与这段30 bp的DNA序列在体外存在直接结合作用.染色质免疫共沉淀实验结果证实,ERα、Sp1与B区存在E2依赖性相互作用.本文在LRP16的5′侧翼区识别了一段最大化呈递E2活性的DNA片段.机制研究表明,在E2存在条件下,ERα通过Sp1与该区域的直接作用上调LRP16基因的表达.     

LRP16基因通过雌激素受体α介导抑制Ishikawa细胞中E-钙黏着素的转录活性

目的:既往研究表明LRP16基因过表达通过下调E-钙黏着素促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的侵袭生长,本研究目的在于探讨LRP16基因下调E-钙黏着素的分子途径。方法:用免疫组化方法检测LRP16基因过表达的Ishikawa细胞中E-钙黏着素的表达;用共转染与荧光素酶实验检测LRP16基因对E-钙黏着素启动子转录活性的影响;用染色质免疫共沉淀实验检测雌激素受体α(ERα)与LRP16蛋白在E-钙黏着素启动子区的招募状况。结果:E-钙黏着素在LRP16过表达的Ishikawa细胞中的表达水平明显下调;LRP16抑制了E-钙黏着素启动子的转录活性,该效应呈现对雌激素(E2)存在的依赖性特征;LRP16本身没有与E-钙黏着素启动子区结合,但明显抑制了ERα与E-钙黏着素启动子区的结合。结论:LRP16通过抑制ERα对E-钙黏着素基因的转录激活活性,下调E-钙黏着素在Ishikawa细胞中的表达水平。     

小分子化合物体外诱导肝上皮样干细胞-WB细胞表达PDX1

目的：近年来干细胞治疗糖尿病一直是国内外研究人员关注的焦点,而肝细胞向胰岛样细胞转变也是热点之一。本实验应用小分子化合物在体外诱导WB-F344大鼠来源肝上皮样干细胞（简写WB细胞）表达胰腺内分泌前体细胞基因PDX1,建立一种体外诱导WB细胞分化为胰腺内分泌前体细胞的实验方法。方法：选用5-AZA TSA,RA,ITS等小分子化合物,分两步法直接诱导WB细胞分化为表达PDX1的胰腺内分泌前体细胞,用含有不同浓度5-AZA分化培养基诱导WB分化,摸索诱导分化的最佳条件。观察细胞形态变化,RT-PCR及实时定量PCR检测部分基因表达情况,免疫荧光检测PDX1的表达。结果：5AZA 5 uM处理2 d,TSA 1 d,RA联合ITS诱导7天,诱导的WB细胞表达PDX1较1-4 uM 5-AZA诱导强,并表达胰腺内分泌前体细胞的相关基因,NGN3,Neurod,NKX2.2,WB表达的Nestin仍持续表达,Insulin1有少量表达。WB表达的肝干细胞基因如ALB,AFP大量下调,标志分化的基因C/EBP下调。结论：5-AZA,TSA,RA,ITS等小分子化合物能够诱导肝上皮样细胞WB表达PDX1,并且这种诱导分化的细胞具有胰腺内分泌前体细胞特征。本实验进一步证明在体外微环境中,肝干细胞能向胰腺内分泌细胞转化,而肝细胞增极强,为将来干细胞治疗糖尿病提供充足的细胞来源     

雌激素通过LRP16基因5′侧翼GC富含区上调其转录的分子机制

LRP16是一个明确的雌激素(E2)反应性靶基因,已往研究在LRP16基因上游调控区鉴定了一个E2反应性1/2ERE/GC富含的ERα作用位点(-676bp到-214bp;命名为A区).为进一步鉴定雌激素上调LRP16基因表达的最大化反应区域,对LRP16基因上游调控区进行缺失突变,通过相对荧光素酶活性分析观察到LRP16基因的一段5′近端侧翼序列(-213bp到-24bp;命名为B区)具有明显的E2反应性.通过与A区比较,认为B区最大化的呈递了E2对LRP16基因的转激活效应.序列分析表明,B区缺乏经典的ERE元件,而包含多个富含GC序列.针对Sp1的siRNA实验结果提示,Sp1参与了E2对该区域的转激活.针对GC富含区进一步的缺失突变,及荧光素酶活性分析,识别了一段30bp(-213bp到-184bp)的序列在B区呈递E2反应活性中发挥核心作用.超级凝胶电泳实验结果表明,Sp1蛋白与这段30bp的DNA序列在体外存在直接结合作用.染色质免疫共沉淀实验结果证实,ERα、Sp1与B区存在E2依赖性相互作用.本文在LRP16的5′-侧翼区识别了一段最大化呈递E2活性的DNA片段.机制研究表明,在E2存在条件下,ERα通过Sp1与该区域的直接作用上调LRP16基因的表达.     

Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞

目的：Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞的研究。方法：利用小鼠慢病毒载体pWPT-Oct4联合包装质粒包装病毒,含有PEG6000的病毒浓缩液对病毒原液进行浓缩;慢病毒浓缩液感染利用两步胶原酶灌流法分离培养的小鼠肝细胞;RT-PCR检测肝脏、胰腺谱系及多能性转录因子表达。结果：含有Oct4慢病毒感染小鼠原代肝细胞后,Oct4出现表达,肝细胞相关转录因子（Alb、Afp）表达逐渐下降,内胚层早期标志物Foxa2的表达随时间的增加而减弱,Sox17在感染后12d、18d出现表达,并表达胰腺发育过程中的关键性基因-胰十二指肠同源异盒蛋白-1（pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1）;不表达Nanog及Sox2等多能性基因。结论：在Oct4介导下成功去分化小鼠原代肝细胞,出现Pdx-1阳性细胞。     

逆转录病毒介导的小干扰RNA稳定抑制了LRP16基因表达

RNA干涉是近年被广泛关注的一项技术,通过19～21nt的双链核酸介导使靶基因mRNA特异降解,目前已被广泛应用于细胞水平的基因功能研究。通过沉默LRP16基因表达介绍一项利用逆转录病毒介导发夹环样小干扰RNA的策略。首先选择了LRP16基因mRNA翻译起始位点下游 374nt和 668nt位置分别作为小干扰RNA作用靶位点,通过设计21nt的反义序列,构建了pL374和pL6682个以pLPC为骨架的逆转录病毒载体,针对绿色荧光蛋白序列构建pGFPi载体做阴性对照,茎环样结构小RNA由U6启动子驱动转录生成。3个载体分别与VSVG共转染293GP2细胞,包装假病毒,再分别感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定生成小干扰RNA的细胞。Northern blot实验表明pL374和pL668可分别将LRP16基因抑制90％和60％,为进一步研究LRP16基因功能奠定了基础。另外,首次将mU6启动子序列插入pLPC逆转录病毒载体骨架,将其改造为可介导发夹环样小干扰RNA产生的质粒载体。     

逆转录病毒介导的小干扰RNA稳定抑制子LRP16基因表达

RNA干涉是近年被广泛关注的一项技术,通过19～21 nt的双链核酸介导使靶基因mRNA特异降解,目前已被广泛应用于细胞水平的基因功能研究.通过沉默LRP16基因表达介绍一项利用逆转录病毒介导发夹环样小干扰RNA的策略.首先选择了LRP16基因mRNA翻译起始位点下游+374 nt和+668 nt位置分别作为小干扰RNA作用靶位点,通过设计21nt的反义序列,构建了pL374和pL668 2个以pLPC为骨架的逆转录病毒载体,针对绿色荧光蛋白序列构建pGFPi载体做阴性对照,茎环样结构小RNA由U6启动子驱动转录生成.3个载体分别与VSVG共转染293GP2细胞,包装假病毒,再分别感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定生成小干扰RNA的细胞.Northern blot实验表明pL374和pL668可分别将LRP16基因抑制90%和60%,为进一步研究LRP16基因功能奠定了基础.另外,首次将mU6启动子序列插入pLPC逆转录病毒载体骨架,将其改造为可介导发夹环样小干扰RNA产生的质粒载体.     

LRP16与 ERα相互作用增强ERα介导的转录活性

LRP16是一个雌激素（E2）通过受体α（ERα）诱导表达的靶基因,LRP16不仅促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,而且促进细胞的侵袭生长,但对LRP16作用的分子机制尚不清楚.首先,检测到LRP16表达缺陷明显削弱了MCF-7细胞对E2的反应性增殖能力;采用Northern 印迹与Western印迹法,进一步检测到抑制LRP16表达,明显损害了ERα靶基因对E2诱导上调的反应性,这些基因包括了cyclin D1, c-myc, c-fos,MTA3, pS2和维甲酸受体α基因（RARα）等;以上结果提示,LRP16参与了ERα介导的信号途径.将ERα模式启动子报告基因3×ERE-TATA-luc,ERα以及LRP16表达载体共转染MCF-7与HeLa细胞.结果发现,LRP16增强了ERα对报告基因的转录激活,并呈现对LRP16的剂量依赖性;进而采用GST-pull down以及免疫共沉淀方法证实了LRP16与ERα之间的直接相互作用,该作用不依赖于E2的存在,但可被E2增强;采用哺乳动物双杂交方法进一步证实了ERα与LRP16相互作用位点存在于A/B区的激活功能域-１（AF1）.以上结果表明,LRP16是ERα的一个共激活因子,通过相互作用,LRP16增强了ERα介导转录活性.该研究为LRP16促进ERα阳性乳腺癌细胞增殖与侵袭生长提供了合理的分子解释.