臭曲霉(Aspergillus foetidus)启动子H8片段克隆及其序列

使用原核及真核菌通用的挑选启动子克隆载体pJGI,从臭曲霉菌体总DNA中分离到具有较好活性的启动子H8片段。根据Southern blot证明该启动子来自臭曲霉菌;H8全片段DNA序列分析结果表明其含有7 50bp,内含典型真核启动子功能序列(TA TA box)及增强子GTGG：TTTAAAG的相似序列,分析证实是一个新的臭曲霉启动子。初步实验表明该启动子不但在臭曲霉菌内有启动功能;并第一次证明来自臭曲霉菌的启动子在原核细胞中也具有启动子活性,能够表达完整的Lacz基因。     

琥珀蚕孵化酶基因AaHE的克隆及启动子活性分析

【目的】琥珀蚕Antheraea assama具有典型的野蚕特征,蚕卵孵化不齐,严重影响琥珀蚕的室内规模化饲养。本研究旨在探究对琥珀蚕卵孵化起关键作用的孵化酶(hatching enzyme)基因及其启动子序列特征,为进一步选择合适的抑制剂或促进剂调节琥珀蚕卵的孵化奠定基础。【方法】采用RACE技术克隆琥珀蚕孵化酶基因的cDNA全长序列,对基因序列进行生物信息学分析;采用qRT-PCR检测琥珀蚕孵化酶基因在琥珀蚕不同发育天数卵中及5龄第3和4天幼虫不同组织(丝腺、马氏管、头、中肠、脂肪体、表皮、血液、精巢和卵巢)中的表达情况;采用染色体步移克隆琥珀蚕孵化酶基因的启动子序列,构建昆虫细胞重组表达载体转染家蚕Bombyx mori BmN细胞,检测琥珀蚕孵化酶基因启动子活性。【结果】获得了琥珀蚕孵化酶基因AaHE(GenBank登录号： KT336227.1)全长cDNA序列,长993 bp,编码294个氨基酸,预测蛋白质分子质量为33.7 kD,理论等电点为5.17。AaHE氨基酸序列含有一个信号肽和一个ZnMc结构域,AaHE是一种含有HExxH锌结合位点的锌依赖性蛋白水解酶,该类酶既是肽酶,同时又是一种消化酶。AaHE在琥珀蚕孵化前的卵及5龄幼虫中肠中特异性高表达,分别与AaHE的肽酶和消化酶的属性相吻合。AaHE启动子核心区存在多个转录因子结合位点,这可能与转录因子参与调节AaHE的表达有关。启动子活性分析表明,AaHE启动子在家蚕BmN细胞中能够启动EGFP基因的表达,具有明显的启动子活性。【结论】AaHE是锌依赖性蛋白水解酶,其启动子核心区存在多个转录因子结合位点。本研究为选择合适的抑制剂或促进剂调节琥珀蚕卵的孵化率提供了参考。     

一种基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统的构建及评价

为构建一种具有广泛适用性的原核启动子报告系统,以质粒pFLX107为骨架,通过多克隆位点替换和序列改造,构建出基于lacZ基因和pUC复制子的pFGH系列报告载体,然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统,并利用诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM分别对其进行测试。结果显示,在所构建的pFGH系列质粒中,pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒,在28 ℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性 (P<0.01)。进一步的评估测试显示,质粒pFGH06可用于诱导型启动子或组成型启动子的克隆及活性测定,且在模拟应用于启动子筛选时,通过蓝白斑筛选即可实现对目标启动子的完全识别。与已报道的原核启动子报告系统相比,pFGH06具有体积小、克隆位点多、背景活性可调、对启动子筛选识别效率高等优点,具有广泛的应用前景。     

染色质调节元件与不同启动子的相互作用对基因表达调控的影响

为探究DNA序列元件对不同启动子调节转基因稳定表达的影响,利用遍在染色质开放元件 (Ubiquitous chromatin opening elements,UCOE) 和基质黏附序列 (Scaffold/matrix-attachment regions,MAR) 分别与含增强子的oct4基因启动子、含CpG岛的sox2基因启动子和不含调控元件的nanog基因启动子以及同时包含增强子和CpG岛的CMV启动子组合构建pOCT4-MAR、pOCT4-UCOE、pSOX2-MAR、pSOX2-UCOE、pNANOG-MAR、pNANOG-UCOE、pCMV-UCOE、pCMV-MAR等质粒,分析这些质粒稳定转染后的表达量和嵌合表达差异。结果发现,UCOE与含增强子元件的oct4启动子组合能较稳定高效表达,而MAR与含CpG岛的sox2启动子组合能较稳定高效表达。利用排除位置效应原因的嵌合表达对染色质高级结构调控基因表达的稳定性分析表明：(1) 通常情况下UCOE比MAR调节的表达载体的表达更高效和更稳定;UCOE连接含CpG岛的启动子形成开放染色质调节的高表达更稳定;(2) MAR与启动子上TATA盒或增强子可能通过染色质环产生高表达,但相对不稳定。结论：染色质调节元件UCOE和MAR与启动子调控元件之间能通过染色质开放状态或染色质环调控基因稳定表达。     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

人脑胶质瘤GDNF基因启动子I区H3组蛋白乙酰化修饰情况

目的：明确GDNF启动子I区在人脑胶质瘤中H,赖氨酸残基9位乙酰化（H3K9Ac）情况,探讨其对于GDNF在胶质瘤中表达的影响。方法：RT-PCR检测各组中GDNFmRNA的表达;建立基于Real．timePCR分析的染色质免疫共沉淀（CHIP）方法,检测12例胶质瘤与6例正常脑组织中GDNF基因启动子I区王H3组蛋白乙酰化情况。结果：Real-timePCR验证人脑胶质瘤GDNFmRNA的表达,转录水平随级另q的增高而增高,且低级别组、高级别组与正常组之间存在显著的统计学差异（P〈0．05）。启动子I区的H,组蛋白乙酰化水平,正常组与低级别组和高级别组之间比较均有显著性差异（P〈0．05）,且低级别与高级别之间也有显著性差异。结论：在人脑胶质瘤组织中,GDNF启动子I区发生了H3组蛋白高乙酰化修饰,这种修饰很可能会影响GDNF基因的表达。     

不同启动子调控羰基还原酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达水平

为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌中的高效表达,以摩氏摩根菌MorganellamorganiiCMCC（B）49208染色体DNA为模板,PCR扩增得到目的基因mldh,分别与启动子PQ和启动子p43进行连接,构建不同启动子组合的表达载体PHY—p43-mldh、PHY—PQ—mldh、PHY—p43-p43-mldh和PHY—p43-PQ—mldh,化学法转化B．subtilisWb600后对重组茵细胞破碎液进行SDS-PAGE分析及全细胞生物转化反应实验发现,4种重组茵的转化能力差异显著,其中重组菌B．subtilisWb600（PHY—p43-p43-mldh）进行全细胞转化反应,转化液中d-伪麻黄碱的浓度最高,达到142．1mg／L,底物转化率为78．25％,成功实现了羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌中的高效表达。     

miR396基因家族的进化及功能分析

MicroRNA(miRNA)是由约22个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA,广泛存在于真核细胞中,通过与靶基因的互补配对在转录后水平对基因表达进行调控,导致mRNA的降解或翻译抑制。本文通过对目前miRBase中收录的miR396家族进行生物信息学分析发现,该家族在植物界中高度保守,它们可能起源于较为古老的物种,经历长期复杂的进化过程而保留了下来;靶基因预测结果显示生长调控因子GRF为其主要靶标;启动子分析表明, miR396编码基因的上游存在光、温度、激素、厌氧、干旱及病害等胁迫响应相关的顺式作用元件,它们可与转录因子结合,参与多种胁迫应答反应。本文可为全面深入研究miRNA的作用机制奠定基础。