藻蓝蛋白对非小细胞肺癌细胞移植瘤生长的抑制及促凋亡作用的机制研究

摘要 目的：探讨藻蓝蛋白对非小细胞肺癌细胞移植瘤生长的抑制及促凋亡作用的机制研究。方法：4~6周龄30只无胸腺BALB/c裸鼠随机分为移植瘤组和藻蓝蛋白组。每5天用卡尺测量裸鼠肿瘤体积。通过RT-PCR检测裸鼠肿瘤中凋亡相关因子MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax的mRNA表达。通过流式细胞术分析细胞周期。通过蛋白印迹分析EMT相关蛋白的表达。通过ELISA检测血浆细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β的浓度。通过蛋白印迹分析STAT3/NF-κB信号通路的表达。结果：第13天时,移植瘤组和蓝藻蛋白组肿瘤大小比较无差异（P>0.05）,第18天和第25天时,藻蓝蛋白组肿瘤体积较移植瘤组减小（P<0.05）。藻蓝蛋白组MMP-2、MMP-9和Bcl-2的mRNA表达较移植瘤组降低（P<0.05）,藻蓝蛋白组Bax mRNA表达较移植瘤组升高（P<0.05）。藻蓝蛋白组G1期占比较移植瘤组升高（P<0.05）,藻蓝蛋白组G1期占比较移植瘤组升高（P<0.05）,藻蓝蛋白组S期和G2期占比较移植瘤组降低（P<0.05）。藻蓝蛋白组N-钙粘蛋白和VEGF蛋白表达较移植瘤组降低（P<0.05）,藻蓝蛋白组E-钙粘蛋白表达较移植瘤组升高（P<0.05）。藻蓝蛋白组TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β的浓度较移植瘤组降低（P<0.05）。藻蓝蛋白组p-STAT3、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达较移植瘤组降低（P<0.05）。结论：藻蓝蛋白通过调控STAT3/ NF-κB信号通路抑制炎性细胞因子的分泌和EMT发生,促进肿瘤细胞凋亡,抑制裸鼠体内移植瘤的生长。     

Aβ寡聚体调控M1胆碱受体下游信号转导通路的机制研究

摘要 目的：阿尔茨海默病（Alzheimer''s disease, AD）病理状态下M1胆碱受体功能受损,无法对配体做出正确响应。本研究模拟AD早期Aβ寡聚体富集的病理状态,考察对M1胆碱受体下游信号通路关键分子活性的影响,以期为AD病理状态下M1胆碱受体信号偶联障碍机制提供新的见解。方法：制备Aβ寡聚体（Aβ oligomers, AβOs）,1 μM AβOs预处理CHO-M1细胞30 min、24 h和48 h,加入胆碱受体激动剂乙酰胆碱或者卡巴胆碱激活M1胆碱受体,利用Ca²⁺检测实验、IP-One-Gq KIT检测实验及Western blot实验检测受体激动后下游关键信号分子Ca²⁺、IP1的释放量以及ERK磷酸化的动态变化。结果：AβOs预处理导致激活细胞内M1胆碱受体其下游Ca²⁺和IP1的释放量减少、ERK被更快激活。结论：AβOs预处理导致激活M1胆碱受体下游关键信号分子释放水平、磷酸化水平异常,揭示在阿尔茨海默病早期M1胆碱受体便出现功能障碍,无法正确激活信号转导通路。     

基于蛋白质互作网络的COVID-19对肺动脉高压的影响机制

通过构建肺动脉高压差异基因和冠状病毒侵入人体后免疫反应相关基因的互作网络,探索COVID-19对肺动脉高压的影响机制。首先通过Meta分析挖掘肺动脉高压相关差异表达基因;其次通过SARS-CoV侵染人体后的基因表达数据,挖掘主要功能通路;最后构建肺动脉高压差异表达基因和冠状病毒主要功能通路基因的互作网络,挖掘网络的显著功能模块。发现肺动脉高压与血管平滑肌细胞、成纤细胞、T/B细胞免疫过程、转录调节因子通路、Toll样信号通路等密切相关,互作网络发现ITGAM、HBB、VCAM1、IL1R2等基因是COVID-19感染肺动脉高压患者的重要调节基因。通过肺动脉高压与冠状病毒感染机体后蛋白质互作网络探索了COVID-19对肺动脉高压的影响机制,为肺动脉高压感染COVID-19的研究及治疗提供了新思路。     

2-12烷基-6-甲氧基环己基-2,5-二烯-1,4-二酮(DMDD)抗弥漫大B淋巴瘤的作用及机制*

目的:探讨2-12烷基-6-甲氧基环己基-2,5-二烯-1,4-二酮(DMDD)抗弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)的作用及分子机制。方法:动物实验取4周龄BALB/C小鼠,分5组,20只/组,腹股沟注射DLBCL细胞株OCI-LY19细胞1 × 10⁷ cells/ml 每只0.1 ml,两天后分别灌胃0、1、5、25、125 mg/kg剂量的DMDD,1次/2天,给药的第18日,杀10只小鼠,取瘤组织称重,记录剩余小鼠的生存期。细胞实验取OCI-LY19细胞加入96孔培养板,每孔100 μl 1×10⁵ cells/ml,分别加入100 μl DMDD使其终浓度分别为0、1、5、25和125 μmol/L,作用0、24、48和72 h,设三复孔,MTS法检测细胞增殖活性;根据细胞增殖实验结果,选择0 μmol/L、5 μmol/L和25 μmol/L的DMDD作为后续用药浓度作用OCI-LY19细胞24 h,流式细胞仪分析凋亡率,hoechst染色观察细胞核型,JC-1染色观察线粒体膜电位,LDH释放实验评估药物细胞毒性,qPCR、Western blot分析基因转录和表达水平。结果:动物实验表明:与0 mg/kg用药组比,1～125 mg/kg DMDD能抑制小鼠瘤组织生长并延长其生存期(P＜0.01)。细胞实验表明:DMDD用药组OCI-LY19细胞增殖活性明显降低、凋亡水平显著增加(P＜0.01),细胞核出现碎裂、凝集和凋亡小体及线粒体膜电位下降,LDH释放率显著增加(P＜0.01),细胞内caspase-3和bax基因的转录表达和IκBα的磷酸化水平显著上调,bcl-2、bcl-xL、jak2和stat3基因的转录和蛋白表达水平明显受抑(P＜0.01)。结论:DMDD通过抑制JAK2/STAT3和NF-κB信号通路中JAK2、STAT3和p-IκBα的表达,下调BCL-2/BAX、活化Caspase-3,最终激活OCI-LY19细胞线粒体凋亡的内源性通路而促进了DLBCL细胞凋亡,抑制了OCI-LY19细胞增殖,具有抗DLBCL的作用。     

缺氧缺糖诱导心肌细胞损伤中Notch信号对HIF-α及自噬相关基因Beclin1,LC3Ⅰ,LC3Ⅱ表达的影响

目的:探讨在缺氧缺糖诱导心肌细胞损伤的模型中Notch信号对低氧诱导因子(HIF-1α)及自噬相关的基因Beclin1,LC3Ⅰ,LC3Ⅱ的影响。方法:利用低氧培养箱与低糖DMEM培养基建立缺氧缺糖细胞(OGD)模型,细胞分为正常对照组,缺氧缺糖组(OGD group),缺氧缺糖+NC siRNA组(OGD+NC siRNA group),缺氧缺糖+Notch1 siRNA组(OGD+Notch1 siRNA group),缺氧缺糖+HIF-1αsiRNA组(OGD+HIF-1αsiRNA group),利用Western blot检测Notch1 siRNA与HIF-1αsiRNA的干预效果;利用Western blot检测Notch1 siRNA对模型细胞中HIF-1α表达的影响;利用CCK-8实验检测Notch1 siRNA与HIF-1αsiRNA对心肌细胞活性的影响;利用Western blot检测Notch1 siRNA与HIF-1αsiRNA对自噬相关的基因Beclin1,LC3Ⅰ,LC3Ⅱ的影响。结果:HIF-1αsiRNA可有效敲低模型心肌细胞HIF-1α的表达,而Notch1 siRNA可有效敲低模型心肌细胞中Notch1与HIF-1α的表达;Notch1 siRNA与HIF-1αsiRNA可降低缺氧缺糖细胞模型中心肌细胞的活性,且二者的作用之间没有统计学差异(P>0.05);Western blot结果显示Notch1 siRNA与HIF-1αsiRNA可降低模型细胞中自噬相关的基因Beclin1,LC3Ⅰ,LC3Ⅱ的表达,降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率。结论:Notch1通过正向调节模型细胞HIF-1α的表达,进而提高缺氧缺糖诱导的自噬,发挥对心肌的保护作用。     

光遗传技术通过Wnt/β-Catenin通路对新生神经元的影响*

目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路光遗传技术在促进新生神经元成熟中的作用。方法:从胎鼠大脑皮层中提取神经干细胞,用携带DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染神经干细胞,观察神经干细胞分化为新生神经元后DCX的表达。实验细胞分为3组(n=9):对照组、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2组。其中对照组为正常培养的NSCs(NSCs组);NSCs+EGFP组为携带DCX-EGFP基因慢病毒感染神经干细胞组;NSCs+ChR2组为携带DCX-ChR2-EGFP基因慢病毒感染神经干细胞组。病毒感染后48 h后连续3 d行470 nm蓝激光照射,然后检测各组NeuN⁺阳性细胞(成熟神经元标志物)的密度和NeuN⁺/Hoechst比值情况;Western blot检测各组成熟神经元相关蛋白MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平和Wnt/β-catenin通道相关蛋白TCF4和β-catenin蛋白的表达水平。用L-型钙通道阻断剂100 μmol/L维拉帕米或50 μg/ml的β-catenin抑制剂Dkk1处理NSCs+ChR2组细胞,然后行Western blot检测各组MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平。结果:连续3 d 470 nm蓝激光照射后,NSCs+ChR2组中NeuN⁺阳性细胞密度(成熟细胞)和NeuN⁺/Hoechst明显高于NSCs组和NSCs+EGFP组(P均＜0.05);Western blot检测的MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、TCF4表达水平均明显高于NSCs组和NSCs+EGFP组(P均＜0.01);L-型钙通道阻断剂维拉帕米或β-catenin抑制剂Dkk1处理NSCs+ChR2组细胞后MAP2、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平明显下降(P均＜ 0.01),NeuN表达水平也下降(P＜0.05)。证明ChR2通道蛋白开放产生阳离子内流促进新生神经元成熟,是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的。结论:光遗传学方法通过Wnt/β-catenin信号通路促进新生神经元成熟。     

小RNA病毒非结构蛋白2B的viroporin特性研究进展

小RNA病毒2B蛋白是一种非结构蛋白,其中部分已被证实隶属于viroporin家族,而viroporin是由病毒编码的一类小分子量疏水跨膜蛋白,可通过增大宿主细胞膜结构通透性扰乱其生理学功能而保证病毒完成生命周期。本文主要对小RNA病毒2B蛋白的viroporin特性及生物学功能进行阐释,以便加深对小RNA病毒复制及增殖的理解,并为抗病毒药物的研发提供参考。     

乙型流感病毒Vero细胞高产适应株传代稳定性研究

由于能快速、大规模生产以应对随时可能暴发的流感,细胞流感疫苗已成为当今流感疫苗的主要研发方向,而选育流感病毒Vero细胞高产适应株对于细胞流感疫苗的研发至关重要。本文旨在研究流感病毒Vero细胞高产适应株BX-51BVa(By)在Vero细胞上的传代稳定性,以证明该毒株是否可以作为制备Vero细胞流感疫苗的种子批。以Vero细胞高产株BX-51BVa(By)在Vero细胞上连续传代50次,测定其血凝效价和感染性滴度,并通过型别鉴定及基因序列测定考察传代过程中生物学性状的稳定性。结果显示BX-51BVa在Vero细胞连续传代50次,血凝效价维持在256～512,感染性滴度稳定在1×107TCID50/mL左右,型别未发生改变,HA和NA氨基酸序列与流行株BX-51B相比没有发生变化。本研究发现B型流感病毒重配株能够稳定地在Vero细胞连续传代,可以作为制备Vero细胞流感疫苗的种子批。     

东北刺人参falcarindiol制备及其抗结肠癌作用机制研究

为建立一种快速高效的falcarindiol(FAD)制备程序并探讨其抑制结肠癌细胞HCT-116增殖作用与调控细胞周期阻滞相关基因之间的关系。研究使用硅胶柱色谱富集及制备HPLC分离纯化得到了FAD单体,依据波谱数据鉴定其结构;采用MTS法检测FAD对结肠癌细胞HCT-116的细胞毒活性,运用流式细胞术、RT-qPCR以及Westernblotting法分别检测FAD对结肠癌细胞HCT-116周期影响、周期阻滞基因β-catenin、cyclinD1和c-myc的mRNA水平及蛋白表达的作用。结果显示建立制备HPLC方法可以较快速稳定地得到较高纯度的FAD。FAD对结肠癌细胞HCT-116具有明显的细胞毒活性,与HCT-116细胞作用24、48、72h的IC50值分别为8.1±1.4、4.6±0.5、3.2±0.4μmoL/L。此外,FAD将HCT-116细胞周期阻滞在G2/M期,且能够显著下调Wnt/β-catenin通路中的β-catenin、cyclinD1和c-myc基因的转录及表达。据此推断FAD可能是通过调节Wnt/β-catenin信号通路阻滞HCT-116细胞生长周期进而抑制其细胞的增殖来产生抗结直肠癌的作用。     

江苏省2013—2014年3株柯萨奇病毒B组5型流行株全基因组序列分析

目的分析引起江苏省疱疹性咽峡炎的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5, CV-B5)毒株基因组特征。方法对江苏省2013—2014年3例疱疹性咽峡炎患儿临床标本进行病原分离,获得3株CV-B5毒株,进行全基因组序列测定,与GenBank中世界各地不同年份CV-B5流行株序列进行比对分析,使用Mega 5.2软件构建系统进化树,并应用Simplot软件进行重组分析。结果获得3株CV-B5毒株,分别命名为417/JS/CHN/2013、492/JS/CHN/2013和759/JS/CHN/2014,均属于GI.D3亚型,且在位点5 224～5 696 bp(以Faulkner为参考株)与2008年北京市的CV-B3流行株(GQ141875)发生重组,在位点5 696 bp之后与2009年昆明市的CV-B3流行株(JX843810)发生重组。结论 CV-B5在婴幼儿人群中的感染可能存在严重危害,应加强对CV-B5的分子流行病学研究,监测可能发生的重组。