基于环氧功能基团的杂化硅胶固定化酶反应器

在蛋白质组学研究中, 为解决自由溶液酶解时间长、蛋白酶自降解等问题, 各种类型的固定化酶反应器引起了人们的关注. 采用溶胶凝胶法, 在100 µm内径毛细管内, 以3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷为功能单体, 以四乙氧基硅烷为交联剂, 制备了一种新型的杂化硅胶整体材料. 并通过在整体柱表面由环氧功能团水解得到的二醇与胰蛋白酶(trypsin)的氨基进行一步反应, 实现了胰蛋白酶固定化. 利用该IMER, 在47 s内实现了牛血清白蛋白的酶解; 经反相色谱分离和质谱鉴定, 序列覆盖率在35%以上, 与自由溶液酶解12 h的效果相当. 结果表明, 基于亲水性杂化硅胶整体材料的IMER有望在蛋白质组学研究中发挥重要作用.     

鸡胚胎干细胞能量代谢的特点

细胞能量代谢与细胞生命活动紧密相关, 但目前对于鸡胚胎干细胞能量代谢特点的研究较少. 本研究利用前期建立的chES细胞模型, 通过电子显微镜发现未分化的chES细胞胞质内储存大量糖原颗粒和卵黄颗粒. 逆转录-聚合酶链反应对能量代谢途径中的主要限速酶的基因表达分析显示, 未分化的chES细胞不表达丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶, 与鸡胚胎成纤维细胞相比低表达葡萄糖转运蛋白1和磷酸果糖激酶, 高表达己糖激酶1和糖原合成酶; 分化中的chES细胞与成年母鸡肝脏相比少量表达PCX和PCK2, 与CEF细胞相比高表达GLUT1, HK1, PFK, 而GYS的表达没有显著性差异. 过碘酸希夫氏染色显示, 细胞培养过程中未分化chES细胞中储存的糖原颗粒未见减少, 而分化中的chES细胞的糖原颗粒逐渐减少. 此外, 通过赫斯特荧光染料33342和碘化丙啶双染色发现, 大量未分化的chES细胞在体外培养过程中死亡, 而添加外源性6-磷酸葡萄糖显著减少细胞死亡. 上述结果说明, 未分化chES细胞主要以糖原合成为主, 无糖异生代谢, 而分化中的chES细胞以糖酵解代谢为主. 未分化的chES细胞以大量消耗代谢中间产物G6P为代价进行糖原合成, 造成细胞内源性G6P相对不足引起细胞死亡. 因此, 细胞内糖原的含量反映了chES细胞的分化程度. chES细胞在体外培养时可通过添加G6P来提高生存率.     

野油菜黄单胞菌6-磷酸果糖激酶基因的初步分析

6-磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的关键酶,它催化糖酵解途径中第一个不可逆反应。本研究利用pK18mobsacB自杀质粒采用同源双交换的方法对野油菜黄单胞菌Xcc8004中的6-磷酸果糖激酶基因(XC_0872)进行缺失突变,获得无标记的缺失突变体DM0872。表型检测结果显示DM0872突变体不影响野油菜黄单胞菌对葡萄糖和果糖的利用,不影响胞外多糖的合成,也不影响其致病性。该结果显示糖酵解途径在野油菜黄单胞菌的地位并不重要。另外,我们利用RT-PCR方法检测了XC_0872的转录情况,结果显示XC_0872在Xcc8004中是转录的。而之前曾有报道称黄单胞菌中无法检测出6-磷酸果糖激酶活性,这表明XC_0872进行了转录后调控从而使6-磷酸果糖激酶活性受到限制。本研究为野油菜黄单胞菌中糖酵解途径的调控提供了理论依据,对揭示野油菜黄单胞菌中该途径的调控机制具有一定的意义。     

宏基因组文库中的组成型启动子在大肠杆菌中的克隆

启动子是决定基因表达水平的重要因素之一。组成型表达启动子被认为是工业上表达重要蛋白质的理想启动子。本研究利用蔗糖为唯一碳源的基本培养基对榨糖废水浸润的土壤微生物宏基因组文库进行筛选,获得两个阳性克隆。对其中一个克隆的柯斯质粒进行亚克隆,利用在线启动子预测和序列比对工具对其中一个亚克隆子进行分析,获得一个启动子序列。然后,利用PCR方法将该启动子和地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因一起克隆到T载体上。结果表明该启动子在不加诱导剂的条件下能够在大肠杆菌中启动外源基因的高效表达。本研究结果为在生物领域中组成型启动子的应用研究提供了基础。     

青花菜ProDH基因的克隆及功能鉴定

脯氨酸是水分胁迫植物中最常见的渗透保护物质之一,脯氨酸脱氢酶(ProDH)是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶,构建RNAi表达载体转化青花菜可以抑制脯氨酸分解提高其抵抗干旱胁迫和盐胁迫的能力。本研究利用同源重组和RACE技术克隆青花菜脯氨酸脱氢酶基因(ProDH),以酶切、连接的方法利用载体pFGC1008构建植物RNAi表达载体pFGC-PDHi。序列分析表明,本文首次克隆了1595bp的青花菜脯氨酸脱氢酶基因cDNA全长,该序列编码498个氨基酸;序列比对发现该核酸序列与拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有83.26%、89.07%和97.73%的同源性,其氨基酸序列和拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有89.78%、91.38%和98.80%的同源性。测序和酶切鉴定表明青花菜ProDH基因RNA干扰表达载体已经构建成功,并将其转化青花菜得到转化株,经PCR检测,转化株均为阳性株,证明干扰载体的T-DNA区已经成功地整合到了青花菜基因组中。研究还发现在外源的L-脯氨酸存在时,转化株的脯氨酸脱氢酶的活性受到了明显的抑制。本研究为青花菜的抗旱育种提供了非常有价值的新种质材料。     

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。     

应答流感病毒感染的宿主信号途径研究进展

一系列广泛的宿主细胞信号转导通路可以被流感病毒感染激活. 一些信号转导通路引起宿主细胞的先天免疫应答来抵抗流感病毒, 而一些其他的信号转导通路却是流感病毒实现高效复制所必需的. 本文综述了宿主细胞中由流感病毒感染引起的胞内信号转导, 包括宿主模式识别受体(PRRs)相关信号, PKC, Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信号, 同时对上述信号通路的下游具体效应进行了总结. 这些效应包括宿主细胞对流感病毒的识别, 流感病毒的吸附及入侵, 流感病毒核蛋白的输出, 病毒蛋白的翻译控制, 流感病毒引起的宿主细胞凋亡. 对流感病毒引起的细胞信号转导的研究有助于更加清晰地认识病毒与宿主的相互作用, 也是寻找新的抗病毒靶点和新的抗病毒策略的基础.     

布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及活性测定

苯丙氨酰-tRNA合成酶是布氏锥虫蛋白合成过程中的一类重要酶,以其为靶点的抑制剂可能发展成为新一代的抗锥虫药物,但此前并没有分离锥虫苯丙氨酸-tRNA合成酶的报道。本研究用大肠杆菌成功克隆表达并纯化了布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶并进行了活性测定。首先通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中分别扩增出苯丙氨酰-tRNA合成酶的α亚基、β亚基的基因,依次克隆入pCOLADuet共表达载体,然后在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中进行了成功表达,并采用Ni-Bind亲和层析对其进行了纯化,最后用免疫印迹进行了鉴定。此外还采用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。     

北美西部古新世-始新世极热事件(PETM)期间的哺乳动物群序列(英文)

跟随一队研究哺乳动物群在古新世-始新世变化的生物地层学和古地理学的学者,已故周明镇教授开始了他的古脊椎动物学事业。这是化石记录中偶蹄类、奇蹄类和灵长类(APP类群)首次出现的时期。随着北美西部Polecat Bench新的最晚古新世Clarkforkian哺乳动物群的发现,古新世作为一个独立于始新世的分期从1911年开始被接受。后来,研究证明古新世-始新世界线包括了一段时间,这期间发育了矮小型哺乳动物支系。古新世-始新世碳同位素漂移(CIE)与哺乳动物矮小化以及APP类群的首次出现是同时的。据此可以对CIE进行全球性总结,结果表明它与古新世-始新世极热事件(PETM)相关。PETM这一全球温室变暖事件不仅对地球气候和生物群有短暂的影响,而且对生物群同样具有深远持续的影响。我们所知的哺乳动物与CIE和PETM之间关系的大部分内容是通过对Polecat Bench周边剖面独特地层记录的高分辨率研究得到的。周教授早年曾在那里工作过,如今他的骨灰也撒在那里。     

疱疹病毒膜融合的分子机制

囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的重要过程,这一过程涉及到病毒囊膜表面糖蛋白与宿主细胞表面受体之间的相互作用和构象变化．疱疹病毒有多个糖蛋白及不同类型的细胞作用受体,相应的受体-糖蛋白复合体构成方式也有多种,其引致的膜融合机制被认为是目前病毒融合机制研究中最复杂的,近年来被广泛研究并取得突破性进展．从病毒糖蛋白与相应受体的结构与功能、受体-糖蛋白复合体的形成与入侵途径,以及膜融合模式几个方面,全面综述疱疹病毒膜融合的分子机制,并展望了未来研究趋势．