油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体的构建

根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。     

南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性

利用兼并性引物和RACE方法, 在南蛇藤(Celastrus orbiculatus)中克隆了1个脯氨酸脱氢酶基因, 并命名为NstProDH1。序列比对显示该基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)的脯氨酸脱氢酶(ProDH)具有很高的同源性。酶学特性分析表明该酶具有脯氨酸脱氢酶的活性。比较南蛇藤不同器官该基因的转录表达模式与脯氨酸脱氢酶活性, 结果显示两者之间没有明显的关联, 说明该基因的表达受到转录和翻译水平的双重调控, 同时也暗示南蛇藤中还存在其它的脯氨酸脱氢酶基因。NstProDH1基因的表达模式与野生型拟南芥中的ProDH1具有相似性, 因此推测NstProDH1基因可能在功能上与拟南芥ProDH1基因相似。     

甘蓝型油菜BnMYC2基因克隆及对植物抗虫胁迫的研究

为了研究髓细胞组织增生蛋白(Myelocytomatosis protein,MYC2)基因与甘蓝型油菜抗虫性的关系,该研究从甘蓝型油菜恢复系R18中克隆获得BnMYC2基因的cDNA序列,并进行了基因表达及转化模式植物拟南芥的抗虫分析。生物信息学分析表明,BnMYC2基因gDNA不具有内含子结构,cDNA完整开放阅读框(ORF)为1 833 bp,编码610个氨基酸,推测BnMYC2基因位于甘蓝型油菜C6染色体上,具有bHLH型转录因子的保守结构域HLH。基因同源性分析结果表明,BnMYC2与拟南芥、甘蓝、萝卜的亲缘关系最近,氨基酸的相似度都在98%以上。组织特异性表达分析显示,BnMYC2在甘蓝型油菜的根、茎、叶、花、授粉后27 d的果荚和授粉后35 d的果荚中均有表达,且授粉后27 d的果荚中的表达水平最高。抗虫胁迫实验的结果显示,过表达BnMYC2拟南芥的抗虫基因VSP2的表达水平显著高于对照,推测甘蓝型油菜BnMYC2基因可能作为重要的调节因子参与虫害胁迫响应;MeJA诱导6 h后,VSP2基因在不同基因型拟南芥的表达量都明显增加,与诱导前相比差异显著,表明BnMYC2正向调...     

甘蓝型油菜γ-TMT基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了甘蓝型油菜γ-TMT基因,并将其克隆到pMD18-T vector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为1 044 bp.将甘蓝型油菜γ-TMT基因定向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物超表达载体.     

油菜AP2/ERF-B4类转录因子克隆及表达载体的构建

利用油菜UniGene数据库,以拟南芥转录因子保守序列为探针,通过电子克隆方法分离得到一个UniGene库Bna.17538,进一步序列拼接得到一个油菜AP2/ERF-B4亚族的转录因子BnaERFB4-1,长度为672 bp,并进行了相关的生物信息学分析.结果显示BnaERFB4-1是亲水性蛋白,蛋白质三级结构与拟南芥RAP2.6L非常相似,蛋白质无序化程度大于拟南芥RAP2.6L.设计引物通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜沪油15幼苗的DNA和cDNA中分离了BnaERFB4-1基因,命名为BnaERFB4-1-Hy15.序列测定和分析显示,来源于沪油15的BnaERFB4-1-Hy15基因与电子克隆的基因序列差异很小,有3个氨基酸位点不同,存在一个内含子.将BnaERFB4-1-Hy15基因通过BamHⅠ和SacⅠ酶切后分别插入酵母表达载体YK3302和植物双元表达载体pYF1404的相应位置,构建了BnaERFB4-1-Hy15基因的酵母体内结合和植物转化载体,为深入研究该基因在油菜抗逆调控中的作用奠定了基础.     

甘蓝型油菜Fad2与Fae1基因双干扰RNAi载体的构建

将来源于甘蓝型油菜XY15的Fad2与Fae1基因编码区,长度分别为349bp和426bp的两个保守序列片段连接成807bp的大片段。然后分别以正反向插入到pFGC5941干扰载体查耳酮合成酶内含子的两端,构建成RNAi载体。以期在菜籽中转录后能有效抑制Fad2与Fae1两个基因的表达。所构建的RNAi载体最终序列全长3kb,经限制性内切酶消化、PCR扩增验证和序列测定,证明目标序列与GenBank数据库中的碱基序列一致,并且为正反向插入到pFGC5941载体上。通过农杆菌介导的油菜转化,已获得油菜抗性再生植株144个。     

甘蓝型油菜TT1基因反义植物表达载体的构建

拟南芥TT1(transparenttesta1)基因编码一个WIP类型锌指蛋白转录因子,调控内种皮发育和原花青素在内种皮的积累。本研究通过PCR扩增了甘蓝型油菜(Brassicanapus)TT1基因家族(BnTT1)的一段特异保守片段TT1A,并将其亚克隆到中间载体pCambia2301G中,构建了TT1反义植物表达载体pCambia2301G-TT1A,通过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。此表达载体的构建为进一步研究TT1基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和利用反义TT1基因遗传转化获得转基因新型黄籽油菜奠定了基础。     

津田芜菁和赤丸芜菁苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆和表达

以UV—A处理津田芜菁和赤丸芜菁块根24h后提取总RNA,再用RT—PCR方法分别克隆BrPAL1和BrPAL2基因的结果表明,BrPAL1和BrPAL2的开放读码框为2169bp,编码722个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrPAL1和BrPAL2与甘蓝型油菜苯丙氨酸解氨酶（PAL）的同源性达99％,第61～559的肽段具有PAL结构域。BrPAL1和BrPAL2的核苷酸序列在9个位置上存在差异,而推导的氨基酸序列仅在3个位置上有差异。BrPAL1和BrPAL2基因有高度同源性。Northern杂交结果显示,UV—A可以诱导BrPAL1和BrPAL2表达,基因的表达量与处理时间呈相关。     

猪轮状病毒JL94株vp4全基因克隆及原核表达载体构建

根据GenBank已发表的猪轮状病毒vp4基因保守序列,设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株vp4全基因;将扩增产物与载体pMD-18T连接进行序列测定并将测序结果同国外分离株进行序列比较。用限制性内切酶BamHI和SalI将vp4基因从pMD-18T-vp4切下;同样用BamHI和SalI双酶切表达载体pGEX-6P-1;将这2个双酶切产物连接并转化,通过酶切鉴定和PCR鉴定证明完成了vp4原核表达载体的构建。测序结果表明:vp4全基因长2362bp,JL94株同国外分离株BEN307株、Gottfried株vp4全基因片段核苷酸同源性分别为93.44%和69.43%;氨基酸同源性分别为96.06%和71.88%。说明JL94株同BEN-307株属同一VP4血清型,而同Gottfried株属于不同血清型。重组原核表达载体pGEX-6P1-vp4的构建为表达VP4蛋白,研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础。     

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEMR-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1 740bp,共编码580个氨基酸.该核酸序列与其它国家报道的多株RHDV序列相互间同源性高达98.2%～99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%～99.1%,为极度保守片段.