拟南芥DREB 1A转录因子的原核表达和多克隆抗体制备

采用PCR技术,从质粒pCAMBIA 1301/DREB 1A中扩增拟南芥DREB 1A转录因子的编码序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中诱导表达,获得分子量约50.4 kDa的融合蛋白,经融合蛋白纯化酶切后免疫家兔获得DREB 1A转录因子特异性的多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定表明,所制备的多克隆抗体的稀释倍数为25 600时,显色仍清晰可见。     

抗酶的研究进展

抗酶（antizyme）是当细胞内多胺水平升高时刺激机体合成的一种小分子量调节蛋白,能特异性地与鸟氨酸脱羧酶（omithine decarboxylase,ODC）结合,经泛素非依赖途径被26S蛋白酶体降解,从而使多胺合成减少;抗酶还可以调节多胺转运,以稳定细胞内多胺水平。近年来随着生物技术的不断发展,对抗酶的认识也逐步深入,本文综述了抗酶家族、合成、作用及定位等方面的研究进展。     

血管紧张素转换酶2-血管紧张素1-7-Mas轴对血管作用的研究进展

血管紧张素转换酶2（ACE2）和Mas受体的发现使人们对肾素-血管紧张素（RAS）有了更全面的认识。ACE2可水解血管紧张素Ⅰ和血管紧张素Ⅱ直接或间接生成血管紧张素1-7（Ang 1-7）,并与高血压的形成密切相关。Ang 1-7主要通过Mas受体引起血管舒张、抑制细胞增殖。ACE2-Ang1-7-Mas轴的发现为RAS的研究、高血压等心血管疾病的防治和新药开发提供了新的思路和方向。     

Sulfolobus acidocaldarius DHH超家族核酸酶Saci0542的酶学特征研究

【目的】以嗜酸嗜热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的DHH超家族核酸酶（Saci0542）为例,研究其核酸外切酶活性特点,为阐明其在DNA代谢中的具体功能提供生化基础。【方法】将嗜酸嗜热硫化叶菌DHH超家族核酸酶Saci0542基因在大肠杆菌中重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯的重组蛋白;利用荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定Saci0542的酶学特征。【结果】重组表达的DHH超家族核酸酶Saci0542具有典型的单链核酸特异性的3’-5’外切酶活性。进一步酶学特征表征结果如下:酶活性依赖于二价金属离子Mn²⁺,而Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等二价金属离子对活性没有明显的促进作用;Saci0542在pH5.5–10的广泛范围内均表现出较高酶活性;高于200 mmol/L的NaCl强烈抑制酶活性;最适反应温度为50–55℃;末端磷酸基团抑制3’-5’外切酶活性。【结论】本研究证实,Saci0542是一种Mn²⁺依赖型3’-...     

作用于cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶的鉴定

【目的】本研究以革兰氏阳性细菌解纤维素梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)为研究对象,筛选作用于纤维小体编码基因簇cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶。【方法】通过对预测的4个假定编码核糖核酸内切酶基因进行基因敲除、体内过表达、体外过表达和活性分析等方法,分析它们对cip-cel mRNA剪切位点的剪切能力。【结果】敲除rnc和rnj基因,对cip-cel mRNA剪切没有任何影响;体内过表达RNase时能够加速cip-cel mRNA的降解,而过表达RNase G时,则结果与野生型对照菌株无异;RNase G基因rng和RNase Y基因rny的体外活性鉴定分析,发现RNase G对体外转录的包含cip-cel mRNA剪切位点的RNA没有作用,而RNase Y能够对其进行剪切和降解。【结论】RNase Y是能够作用于cip-cel mRNA的核酸内切酶。该研究结果对理解革兰氏阳性细菌核糖核酸内切酶的作用机制,及其在转录后水平的调控基因差异表达等方面具有重大意义。     

鲤源产β-甘露聚糖酶Bacillus velezensis HF-14109的分离鉴定及其酶学和生物学特性研究

【目的】以黄河鲤为材料,从其肠道内分离具有产β-甘露聚糖酶功能的益生菌。【方法】采用平板水解圈法初筛,摇瓶发酵法复筛获得产β-甘露聚糖酶的菌株,通过形态学观察、生理生化试验、16S r RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,并用DNS定糖法测定酶学活性,用耐高温、耐酸、耐胆盐和平板打孔扩散法对其益生特性进行研究,用滤纸片法、腹腔注射法等对其生物安全性进行评价。【结果】本研究通过刚果红染色从鲤肠道中分离筛选出产β-甘露聚糖酶的细菌62株,其中HF-14109菌株产酶能力最强。通过形态学观察、生理生化试验、16Sr RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为45°C、最适p H为6.0,在温度20–80°C、p H 4.0–9.0范围内都较为稳定;Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ba²⁺对该酶具有激活作用,而Mn²⁺、Ca²⁺对该酶具有抑制作...     

一种来源于Phialophora attae的玉米赤霉烯酮内酯水解酶ZHD11F的酶学表征和结构特点

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一种雌激素类真菌毒素,可以与动物的雌激素受体竞争性结合,导致动物生殖系统内的激素紊乱。ZEN内酯水解酶(ZEN lactone hydrolase,ZHD)可以水解ZEN中的内酯键,进而使其转化为无雌激素毒性的产物。【目的】利用生物信息学分析以及酶学性质探索,鉴定出一个具有新特性的ZEN内酯水解酶。【方法】构建pET28a-zhd11f表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达ZHD11F,利用Ni-NTA纯化得到ZHD11F,对其酶学性质进行分析,并通过结构模拟和分子动力学分析阐明ZHD11F低温活性的机制。【结果】ZHD11F以ZEN为底物,比酶活为40.04 U/mg,最适反应温度与pH值分别为35 °C和8.0,在pH 6.0–9.5的范围内具有超过60%的酶活力,在35 °C以下具有较好的热稳定性,能够耐受多种金属离子。ZHD11F在10 °C和20 °C时,其活性分别保持20%和40%。更多的loop区增加了结构的柔韧性是该酶稳定性较差、在低温活性比较高的主要原因。【结论】Phialophora attae是瓶霉属的一种真菌,目前此真菌来源的酶极少被鉴定。关于本研究将Phialophora attae来源的ZEN内酯水解酶ZHD11F,在大肠杆菌中成功可溶性表达并得到纯酶,表征分析显示该酶是目前报道的第一个低温ZEN内酯水解酶,为研究此类酶的耐冷机制、广温度范围提供了候选,同时拓展了Phialophora attae来源酶的功能研究。     

两株内生芽孢杆菌对盐胁迫下大豆幼苗超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性影响

【背景】盐胁迫环境严重影响大豆幼苗生长,内生菌可提高作物的抗逆性。【目的】探究接种内生枯草芽孢杆菌127和解蛋白芽孢杆菌133对盐胁迫下大豆幼苗体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)活性的影响。【方法】以“徐豆20”为实验材料,采用盆栽实验法,设置对照组、盐胁迫组和盐胁迫接菌组,在人工气候培养条件下,用不同NaCl浓度(50、100、150、200、250和300 mmol/L)处理大豆幼苗,并接种不同OD600值(OD0.33、OD0.50和OD0.75)的菌悬液。【结果】培养14 d,接种枯草芽孢杆菌127的菌悬液OD0.33和OD0.75分别在盐浓度300 mmol/L和100 mmol/L时,SOD活性均为1.04 U/g-FW;接种解蛋白芽孢杆菌133的菌悬液OD0.50在盐浓度300 mmol/L胁迫下POD活性最高为7 820 U/(g·min),对大豆幼苗修复效果较显著。培养28 d,接种枯草芽孢杆菌127的菌悬液OD0.50,在150 mmol/L时SOD活性最高(0.88 U/g-FW);接...     

细菌降解双酚类化合物的分子机制研究进展

双酚类化合物(bisphenols,BPs)作为工业原料及药物和个人护理品的重要成分之一,在自然界中广泛分布。BPs作为类雌性激素造成的生态风险已成为全球备受关注的环境问题之一。研究人员使用不同方式分离得到菌株或菌群,尝试对BPs进行无害化降解,目前已取得了一些重要的研究进展。本文对近年来细菌降解BPs的相关研究进行了系统梳理,重点关注以双酚A(bisphenol A,BPA)为典型BPs的细菌降解,总结不同路径中的关键作用基因,讨论相同路径中酶的差异及作用方式,并分析其对BPA的降解效果。本文也简要总结了双酚S(bisphenolS,BPS)和其他BPs的细菌降解研究情况。通过总结讨论现有成果,分析细菌降解BPs中尚需深入研究的内容,探寻未来BPs细菌降解机理及应用的研究方向。     

生物炭-牛粪堆肥中产β-葡聚糖苷酶微生物群落应答碳代谢抑制效应

【背景】在高浓度葡萄糖引起的碳代谢抑制效应下,产β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase)功能微生物群落为适应碳代谢压力的变化,会差异化表达糖耐受和非糖耐受的功能基因。在堆肥中添加生物炭可以改变微生物生存的环境,进而影响微生物群落的组成与功能。【目的】分析在不同碳代谢压力下添加生物炭对产β-葡聚糖苷酶功能微生物群落的结构组成与功能的影响。【方法】在生物炭牛粪-稻草堆肥中添加葡萄糖、纤维二糖及β-葡聚糖苷酶抑制剂,构建不同的碳代谢压力。以细菌来源GH1家族的β-葡聚糖苷酶基因为分子标记基因构建基因克隆文库。同时测定羧甲基纤维素酶酶活和β-葡聚糖苷酶酶活。【结果】放线菌、变形菌和拟杆菌是功能微生物群落中的优势菌群。其中,CL处理组变形菌数量有所下降,在添加了抑制剂的处理组中,拟杆菌的数量明显上升。高浓度葡萄糖显著抑制了羧甲基纤维素酶酶活,但对β-葡聚糖苷酶酶活影响不大,其中低浓度纤维二糖的处理可以显著诱导β-葡聚糖苷酶活性。GHCH处理组中β-葡聚糖苷酶表现出高浓度葡萄糖激活特性。【结论】添加生物炭未明显影响参与纤维素降解的功能微生物群落对碳代谢抑制效应的应答。与自然堆肥相比,在添加了生...