作用于cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶的鉴定

【目的】本研究以革兰氏阳性细菌解纤维素梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)为研究对象,筛选作用于纤维小体编码基因簇cip-cel mRNA的核糖核酸内切酶。【方法】通过对预测的4个假定编码核糖核酸内切酶基因进行基因敲除、体内过表达、体外过表达和活性分析等方法,分析它们对cip-cel mRNA剪切位点的剪切能力。【结果】敲除rnc和rnj基因,对cip-cel mRNA剪切没有任何影响;体内过表达RNase时能够加速cip-cel mRNA的降解,而过表达RNase G时,则结果与野生型对照菌株无异;RNase G基因rng和RNase Y基因rny的体外活性鉴定分析,发现RNase G对体外转录的包含cip-cel mRNA剪切位点的RNA没有作用,而RNase Y能够对其进行剪切和降解。【结论】RNase Y是能够作用于cip-cel mRNA的核酸内切酶。该研究结果对理解革兰氏阳性细菌核糖核酸内切酶的作用机制,及其在转录后水平的调控基因差异表达等方面具有重大意义。     

基于荧光染料Cy5.5标记的引物延伸法鉴定细菌RNA剪切加工位点

【背景】传统引物延伸法常与放射性标记结合使用,但由于放射性元素半衰期短、危害人体健康及严格的操作要求等限制了其在一般实验室的广泛使用。因此,开发新型非放射性引物延伸法成为当前研究的热点。【目的】建立非放射性的引物延伸法,并利用该方法实现对细菌RNA剪切加工位点的鉴定。【方法】将包含RNA剪切位点的序列克隆至双荧光报告系统,然后利用荧光染料Cy5.5标记的特异性靶向mcherry寡核苷酸引物进行延伸,并辅以Northern blotting、RT-qPCR等技术,确定RNA剪切加工的精确位点。【结果】鉴定了来自解纤维梭菌cip-cel mRNA中的2个剪切加工位点均位于颈环结构下游的单链区域,且在剪切位点附近未发现保守序列。【结论】基于Cy5.5标记的引物延伸法能够精确鉴定RNA剪切加工位点,且与传统的放射性引物延伸法相比,该方法具有更高的安全性和更快的检测速度,能够满足一般实验室的实验要求。     

人工纤维小体骨架蛋白的分子设计与自组装

纤维小体是厌氧微生物分泌的能够高效降解木质纤维素的一种多酶复合体。其骨架蛋白质的大量重组合成是人工纤维小体构建的关键。为了构建全长的结构复杂的能招募大量酶亚基的骨架蛋白质,本研究对解纤维梭菌Ruminiclostridum cellulolyticum骨架蛋白CipC进行分子模块化设计,并分别与肽-蛋白质共价偶联系统SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher融合表达。然后分别通过非固定化和固定化组装策略对人工纤维小体骨架蛋白质进行了初步组装。结果显示,SpyTag和SpyCatcher、SnoopTag和SnoopCatcher之间自发形成稳定的共价异肽键,而且SpyTag和SnoopCatcher,SnoopTag和SpyCacther之间无交叉反应。最终成功组装出含有不同数量黏附域的骨架蛋白质,实现骨架蛋白链的延伸。本研究为构建结构更复杂、活性更高的人工纤维小体提供了新的设计思路并奠定了其技术基础。     

Intein介导的重组昆虫毒素BmK IT在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及活性分析

为获得重组蝎昆虫毒素BmK IT,通过PCR方法在BmK IT基因的3′端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽 Ssp DnaB Intein基因下游的多克隆位点（MCS）。将获得的表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导融合蛋白表达。用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了CBD-Intein-BmK IT^his6融合蛋白,并在柱上诱导Intein自剪切,成功去除融合子CBD-Intein。通过Superdex 75凝胶过滤层析获得了纯度达95%以上的BmK IT^his6蛋白,该蛋白不仅具有正确的二级结构而且有生物活性。     

解纤维梭菌纤维小体黏附域与锚定域相互作用的差异性

黏附域(cohesin)与锚定域(dockerin)的相互作用是纤维素酶复合体-纤维小体(cellulosome)组装的基础,该作用是自然界已知最强的相互作用力之一。为解析纤维小体的装配机制,本研究以解纤维梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)纤维小体为研究对象,通过Pull-down和等温滴定量热(ITC)的方法,分析并比较不同簇的3个黏附域与7个锚定域之间的相互作用。结果表明,不同簇黏附域与锚定域的相互作用具有显著差异。其中,Coh1与Doc-0729的相互作用最强,K_a为10⁸ M^-1,Coh7与Doc-0729、0931作用力强,K_a为10⁷ M^-1,而Coh8 与Doc-0931、1656、0752作用强,K_a也达到10⁷ M^-1。总之,Doc-0729、0931、1656与3个Coh的结合力均较高。本研究揭示了纤维小体黏附域与锚定域的组装具有偏爱性,这为人工纤维小体的设计和装配奠定了理论基础。     

Intein介导的重组昆虫毒素BmK IT在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及活性分析

为获得重组蝎昆虫毒素BmKIT,通过PCR方法在BmKIT基因的3′端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽Ssp DnaB Intein基因下游的多克隆位点(MCS)。将获得的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导融合蛋白表达。用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了CBD-Intein-BmK IThis6融合蛋白,并在柱上诱导Intein自剪切,成功去除融合子CBD-Intein。通过Superdex75凝胶过滤层析获得了纯度达95%以上的BmK IThis6蛋白,该蛋白不仅具有正确的二级结构而且有生物活性。     

Intein介导的重组昆虫毒素BmK IT在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及活性分析

为获得重组蝎昆虫毒素BmK IT,通过PCR方法在BmK IT基因的3′端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽 Ssp DnaB Intein基因下游的多克隆位点（MCS）。将获得的表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导融合蛋白表达。用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了CBD-Intein-BmK IT^his6融合蛋白,并在柱上诱导Intein自剪切,成功去除融合子CBD-Intein。通过Superdex 75凝胶过滤层析获得了纯度达95%以上的BmK IT^his6蛋白,该蛋白不仅具有正确的二级结构而且有生物活性。     

超声波介导的微生物细胞转化

随着分子生物学的发展, 微生物遗传改造越来越广泛地应用在微生物育种、临床医学、环境保护等方面。其中, DNA转化技术经常是高效遗传改造的瓶颈之一。应用超声波将目的基因导入微生物细胞的技术具有原位、多尺度、活体、高通量、低成本等优点, 因此发展较为迅速。其原理是超声波可以通过声学气穴现象产生一系列的非热能效应, 而声学气穴微泡可产生短暂的细胞膜透化作用。本文综述了超声波转化的基本原理及其在微生物细胞转化中的发展现状, 并结合本实验室应用超声波转化法转化革兰氏阳性菌等研究进展, 分析了其特色、优势及现存挑战。