两种标记方法对60mer寡核苷酸芯片背景信号影响的初步分析

研究两种不同的样本标记方法对人全基因组高密度60mer寡核苷酸芯片背景信号的影响。收集5对患病与健康人外周血单个核细胞,分别提取总RNA后,采用限制性显示技术（restriction display,RD）进行样本双色（Cy3/Cy5）荧光标记,与5张Agilent 60mer高密度（22K）Human 1B寡核苷酸芯片进行杂交。芯片全部杂交点分3组：基因探针组、阳性对照组和阴性对照组。阳性对照采用荧光标记寡核苷酸直接掺入法进行标记。对全部杂交信号点的Cy3和Cy5背景信号值,用SPSS软件进行数据转换、正态性检验、方差齐性检验、变异系数分析和重复数据的方差分析。数据分析结果显示,Cy3 标记的背景信号值均高于 Cy5标记的背景信号值。重复测量数据的方差分析表明,在Cy3 和Cy5标记中,两种不同标记方法间的背景信号值的差异极显著（PCy3＜0.01, PCy5＜0.01）,且RD标记点的背景信号平均值低于荧光标记寡核苷酸直接掺入标记法标记的阳性对照点。RD标记方法是一种有用的低背景信号的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。     

mtCOI PCR-RFLP技术鉴别中国入侵型和土著型烟粉虱种群的有效性分析

烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)是世界范围内最重要的入侵生物之一,准确地鉴别烟粉虱入侵生物型和土著生物型具有十分重要的现实意义。mtCOI PCR-RFLP技术具有快速、高效的特点,是当前应用最广泛的烟粉虱生物型鉴定技术,但是,不同限制性内切酶为基础的mtCOI PCR-RFLP技术在鉴定我国烟粉虱种群中的有效性仍不明了。本文比较了已报导的5种mtCOI PCR-RFLP技术在鉴别中国烟粉虱种群入侵生物型和土著生物型(B型、Q型,ZHJ1型、ZHJ2型、ZHJ3型)的有效性。结果表明,内切酶AluI不能区分B型和ZHJ2型烟粉虱;内切酶TaqI不能准确区分ZHJ3型和Q型烟粉虱个体;而内切酶VspI不仅不能准确区分ZHJ1型和Q型烟粉虱个体,也不能准确区分B型和ZHJ2型烟粉虱;内切酶MseI和Tru9I则不能有效鉴别上述5种烟粉虱生物型,因此不适宜推广使用。     

都柏林念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的建立一种准确、可靠的鉴定都柏林念珠菌基因型的方法。方法临床念珠菌分离自临床生殖器念珠菌病患者,45℃温度试验时几乎不生长,且其他表型实验结果也符合都柏林念珠菌特征。对41例临床念珠菌和1例白念珠菌标准株、1例都柏林念珠菌标准株rDNA内部转录间隔区的基因进行聚合酶链反应（PCR）扩增,HpyF10Ⅵ酶切后观察PAGE图谱。结果聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）后,39例临床株鉴定为白念珠菌。2例临床菌株带型特殊,测序后行BLAST比对分析,1例鉴定为白念珠菌,另1例尚不能肯定为都柏林念珠菌,还需要进一步以其他分子生物学方法鉴定。结论PCR-RFLP方法酶切后两种念珠菌带型区分明显,可以鉴别大部分临床菌株。基因测序是该方法有意义的补充。     

临床常见镰刀菌的鉴别

目的从分子生物学角度寻找一种快速准确鉴定临床常见镰刀菌的方法。方法将受试镰刀菌接种于PDA培养基,观察其菌落及镜下形态,在此基础上PCR扩增受试镰刀菌的rDNA ITS并测其序列,在GenBank核酸序列数据库进行同源序列搜索及分析。选择限制性内切酶Dra Ⅱ和Cfr13 Ⅰ进行RFLP。设计了茄病镰刀菌的种特异性引物Sol1、Sol2,初步验证其特异性。结果形态学鉴定结果显示,茄病镰刀菌所占比例最高,除2株串珠镰刀菌外,其余镰刀菌ITS序列分析的结果与形态学鉴定结果一致。茄病、层生和串珠镰刀菌的Dra Ⅱ、Cfr13 I酶切带形互不相同。用Sol1、Sol2扩增受试菌的rDNA ITS,只有茄病镰刀菌为阳性。结论rDNA ITS序列测定及其PCR-RFLP可用于初步鉴别几种临床常见镰刀菌,合适的种特异性引物可以初步快速鉴定茄病镰刀菌。     

乙型肝炎病毒基因型与免疫复合物型治疗性乙肝疫苗应答相关性的研究

目的 研究对免疫复合物型治疗性乙肝疫苗不同应答乙肝患者的乙肝病毒基因型有无差别。方法 收集67例经60 ug HBsAg-HBIG (YIC) 治疗的慢性乙肝患者血清, 用S基因聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法对其进行HBV基因分型,并结合患者对YIC治疗的不同应答进行分析。结果67例感染乙肝病毒（HBV）患者中,HBV B基因型22例,C基因型43例,未确定者2例。感染HBV B, C 两种基因型的患者对YIC免疫治疗的病毒学与HBeAg的血清转换应答差异无统计学意义. 结论HBV B或C基因型不影响慢性乙肝患者对YIC的治疗应答。     

FMMU白化豚鼠线粒体DNA RFLP分析研究

目的研究FMMU白化豚鼠的mtDNA,并与花色豚鼠mtDNA进行多态性分析比较,以确定其独特的生物学特性是否与mtDNA相关。方法用碱变性法提取FMMU白化豚鼠以及花色豚鼠的mtDNA,并用AvaⅠ、BalⅠ等12种限制性内切酶进行酶切和限制性片段长度多态性分析。结果与结论FMMU白化豚鼠mtDNA和花色豚鼠mtDNA的相对分子质量相同,约为16.7×103;FMMU白化豚鼠与花色豚鼠两品系的mtDNA经AvaⅠ、BalⅠ等内切酶酶切后有3-8个酶切位点,酶切图谱完全相同,经RFLP分析FMMU白化豚鼠与花色豚鼠的mtDNA之间缺乏多态性。本实验没有发现FMMU白化豚鼠的独特的生物学特性与mtDNA相关。     

病毒分离和PCR-RFLP法对急性结膜炎标本中腺病毒感染及其型别的分析

目的分析2003年下半年收集的哈尔滨医科大学第一临床医学院急性结膜炎标本中的腺病毒(Adenovirus,AdV)感染情况及其型别。方法采集59例临床确诊为急性结膜炎患者的结膜拭子标本,在观察和分析接种细胞的病变(CPE)情况的基础上,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR—RFLP)法,特异性检测CPE阳性细胞中腺病毒核酸的存在情况,并对PCR阳性扩增产物进行病毒型别的分析。结果70．7％(41／59)的急性结膜炎标本接种于培养细胞后可以引起明显的CPE;其中,53．6％(22／41)的CPE阳性标本可以扩增出腺病毒核酸,RFLP分析证实68．18％(15／22)的腺病毒感染为Ad3型,31．82％(7／22)的腺病毒感染为Ad7。结论2003年下半年哈尔滨市急性结膜炎主要以腺病毒3、7型感染为主。提示结合病毒分离培养和PCR—RFLP方法,可以广泛应用于急性结膜炎相关的病毒感染及其型别的进一步分析与研究。     

恒河猴群微卫星DNA多态性的分析

目的　确立一种对恒河猴群个体的遗传物质进行准确可靠、快速简便的遗传检测方法。方法　利用聚合酶链反应 (PCR)扩增技术对 2 0只恒河猴群个体间进行了DNA多态性的分析。结果　筛选出 9个微卫星DNA位点具有显著多态性 ,4个微卫星DNA位点没有多态性 ,还有 2个位点等位基因数目较少。结论　利用这些多态性微卫星位点建立一种对恒河猴群个体进行有效、准备可靠、快捷简便的遗传背景监测方法。     

斑马鱼二价体制备与多重带显带的方法学探讨

采用碱性低渗结合高氯仿一步显带技术获得了斑马鱼二价体高分辨多重G带,所出现的带纹丰富,反差明显。采用地高辛为标记的以限制性内切酶AfuⅠ介导的原位切口平移技术使斑马鱼二价体上呈现出类G带的多重带,获得了明暗反差强烈的带纹结果。通过比较多个不同分裂相的多条染色体,发现带纹的分布具明显特征性．并且特征一致,带纹数目基本吻合。首次从方法学上对斑马鱼二价体的制备过程及多重带显带技术进行了分析、探讨和总结,力求将该技术程序化、系统化,使其具有可重复性和可操作性,并对显带的可能机理进行了讨论。     

利用蛋白质限制性水解法解析大肠杆菌T蛋白的独立结构域

为了解析分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶在大肠杆菌T蛋白的定位,根据T蛋白限制性水解结果,分段克隆分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶.T蛋白限制性水解结果显示,第93位氨基酸是大片段的N端,分段克隆的1～93 片段测定得到分支酸变位酶活性,96～373片段得到了预苯酸脱氢酶活性.研究表明,大肠杆菌T蛋白由两个独立结构域组成,N端93个氨基酸组成了分支酸变位酶,C端277个氨基酸组成了预苯酸脱氢酶.