2009年诺贝尔生理学或医学奖

2009年诺贝尔生理学或医学奖被授予了三位科学家Elizabeth H．Blackburn、Carol W．Greider和Jack W．Szostak,以表彰他们解决了生物学中的一个重要问题：在细胞分裂期间,染色体是如何被完整地复制的,它们又是如何受到保护而不被降解。三位获奖者在染色体的末端——端粒找到了答案,并且发现了形成端粒的酶——端粒酶。     

端粒和端粒酶的发现及其生物学意义

2009年的诺贝尔生理学或医学奖授予了美国加州大学旧金山分校的Elizabeth H．Blackburn、约翰霍普金斯大学的Carol W．Greider以及哈佛医学院的Jack W．Szostak三位科学家,肯定他们在发现端粒以及端粒酶保护染色体末端方面所做出的贡献。端粒以及端粒酶的发现历经近半个世纪,追溯起端粒和端粒酶的整个发现过程,却是耐人寻味,给人启发。端粒是真核生物中位于染色体末端的DNA和蛋白质的复合物,它对于维持基因组的完整性以及染色体的稳定性都有着至关重要的作用。端粒DNA可以被一种特化的称为“端粒酶”的逆转录酶延伸。端粒长度的维持以及端粒结构的稳定在细胞衰老、癌症发生以及干细胞全能性自我更新能力维持等生命过程中都起重要作用。     

E-box元件修饰端粒酶核心启动子序列及体外转录活性分析

人类端粒酶启动子(hTERT启动子)在肿瘤基因治疗中的有效性已经得到了证实. 然而,hTERT启动子有限的肿瘤靶向转录活性困扰着它的临床应用.早期研究已经揭示,核心hTERT启动子上的-34位E-box元件与该启动子的肿瘤靶向转录活性有关.为进一步探索核心hTERT启动子序列3′端富余E-box元件是否能提高启动子的肿瘤靶向转录能力,用化学合成方法在野生型hTERT(WT-hTERT)核心启动子片段(编码蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3′端接入3个E-box序列, 构建成修饰型hTERT(Mod-hTERT)启动子. 然后,分别用WT-hTERT和Mod-hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS、以及原代培养人成纤维细胞(PHF)中表达. 结果表明, 在Mod-hTERT启动子的各实验组细胞中,能够在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ及 SGC7901细胞组中观测到EGFP的表达,而在端粒酶阴性的U2OS及PHF细胞组中没有观测到EGFP的表达;在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ和SGC7901细胞株中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性要高于WT-hTERT启动子组（P＜0.01）; 而在端粒酶阴性的U2OS细胞组中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性则低于WT-hTERT启动子组（P＜0.01); 在PHF细胞组中,Mod-hTERT启动子组与WT-hTERT启动子组的荧光素酶活性差异不显著(P＞0.05).研究提示,在3′端增加E-box元件可以提高核心hTERT启动子序列的肿瘤靶向转录活性.     

不结球白菜Tyl-copia类逆转座子序列的克隆及表达

参照Tyl-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物,分别从10个不结球白菜（Brassica campestris ssp．chinensis）品种的全基因组中均扩增出260bp左右的目标条带。将目的条带回收、克隆和测序后进行分析,DNAstar分析发现,这些序列存在高度的异质性,28个核苷酸序列变化范围为224～278bp,同源性范围为16．7％～83．0％。28条序列通过核苷酸聚类分为8个家族。推导氨基酸序列有移框突变、终止子突变或二者兼有;与已登录的不同物种同一类型逆转录酶氨基酸系统进化树分析表明,不结球白菜Tyl-copia类逆转座子与芥菜型油菜、拟南芥、芜菁、甜菜可能有共同的起源。半定量和实时定量PCR检测表明,水杨酸（salicylicacid）和Peronospora parasitica均能激活不结球白菜Tyl-copia类逆转座子,逆转座子在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性。     

不结球白菜Ty1-copia类逆转座子序列的克隆及表达

参照Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物,分别从10个不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)品种的全基因组中均扩增出260 bp左右的目标条带. 将目的条带回收、克隆和测序后进行分析,DNAstar分析发现,这些序列存在高度的异质性,28个核苷酸序列变化范围为224～278 bp,同源性范围为16.7%～83.0%.28条序列通过核苷酸聚类分为8个家族.推导氨基酸序列有移框突变、终止子突变或二者兼有;与已登录的不同物种同一类型逆转录酶氨基酸系统进化树分析表明,不结球白菜Ty1-copia类逆转座子与芥菜型油菜、拟南芥、芜菁、甜菜可能有共同的起源.半定量和实时定量PCR检测表明,水杨酸(salicylic acid)和Peronospora parasitica均能激活不结球白菜Ty1-copia类逆转座子,逆转座子在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性.     

端粒和端粒酶的发现历程

端粒是染色体末端的特殊结构,它由简单重复的DNA序列和与之结合的蛋白质构成,保护染色体末端不被降解或融合,并使染色体能够完全复制。端粒酶是特殊的逆转录酶,它利用自身的RNA亚基作为模板复制出端粒DNA。端粒和端粒酶的研究进程中贯穿着发现现象/问题-提出概念/模型-实验验证的思路,整个过程就像相继解开一个个谜团一样有趣。因此它是一个很好的科学问题推演的案例。本文以时间为顺序进行整理,重现了这一发现历程。     

构建一种受hTERT启动子和miR-145双调控的更为安全的新型溶瘤腺病毒

目的:构建一种受人端粒酶逆转录酶(h TERT)启动子和mi R-145双调控的更加安全的条件复制型腺病毒。方法:在已构建的h TERT启动子调控早期复制必需基因E1A的条件复制型腺病毒Adzq11基础上,再将四个拷贝的mi R-145的靶序列加入到E1A的3'非翻译区,构建新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T。应用Real-time PCR测定人非小细胞肺癌细胞A549和人胚肺成纤维细胞HLF中mi R-145的表达量;然后在这两株细胞中,分别转染Adzq11和Adzq11-145T对应的穿梭质粒及感染病毒本身,用Real-time PCR检测E1A表达量以测定调控效果;用病毒空斑单位法检测两种病毒的复制情况;用CCK8检测对A549和HLF细胞的杀伤作用。结果:构建的新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T在HLF中复制量明显低于Adzq11,其E1A m RNA水平和杀伤效应也显著降低。而在A549中,Adzq11-145T在E1A表达、病毒复制和溶瘤能力方面较Adzq11均无显著降低。结论:成功构建出一种新的受转录和转录后水平双重调控的条件复制型腺病毒Adzq11-145T,它比仅加入h TERT启动子调控早期复制必需基因E1A的腺病毒Adzq11更加安全。     

中国汉族人群长寿老人TERT基因MNS16A长度多态研究

近期研究表明,TERT基因中的一个串联重复长度多态MNS16A可以调节端粒酶的活性.以往研究报道,端粒酶的活性决定端粒长度从而与个体的寿命相关,据此提出假设:MNS16A的多态可能通过控制端粒长度从而影响人类的寿命.为验证该假设,本实验室从四川省都江堰市收集了446个相互没有亲缘关系的长寿老人(年龄≥90岁,平均年龄(94.45±3.45)岁),同时收集了332个正常个体作为对照组(年龄22~53岁,平均年龄(35.00±12.00)岁).检测长寿组和对照组的MNS16A长度多态,并将两组人群的MNS16A等位基因频率和基因型分布通过卡方检验进行分析.结果表明,在长寿组和对照组之间,MNS16A等位基因频率和基因型分布没有显著差异,表明MNS16A的长度多态在中国汉族人群中可能对寿命长度没有显著影响.     

端粒和端粒酶在癌症中的研究进展及意义

端粒是位于染色体末端的DNA串联重复序列,对基因组稳定性和完整性起保护作用。端粒的长度与细胞周期密切相关。其长度变化机制分为依赖端粒酶活性和端粒重组两类,氧化应激和铅(Pb)与端粒酶的功能蛋白相结合抑制其活性,致使端粒缩短,硒(Se)与二者具有拮抗作用,延缓衰老。相关数据表明85%肿瘤细胞与端粒酶活性成正相关,以端粒酶活性作为肿瘤治疗靶标称为当代热点之一。主要对肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤与端粒的相关性进行了综述,以期为端粒和端粒酶在癌症治疗研究提供参考依据。