多重PCR在质粒拷贝数检测中的应用

聚合酶链式反应(PCR)作为常规分子克隆技术已在分子生物学的各个领域得到广泛应用.然而,多重PCR技术应用于质粒拷贝数检测的研究尚未见报道.为深入探索多重PCR在质粒拷贝数测定中的应用,首先利用构建的多重PCR引物设计及评估体系分别针对细菌基因组DNA和质粒载体DNA序列设计多重PCR引物;然后以转化有不同质粒载体的大...     

SV40PolyA片段串联拷贝数目影响GFP报告基因表达

Alu元件（约280bp）是人类基因组中的重要重复序列,串联Alu呈长度依赖性下调GFP报告基因表达,在Alu串联序列上游正向或反向插入SV40PolyA（简称PolyA,240bp）,解除Alu串联序列对GFP基因的抑制作用.PCR法扩增PolyA反序（PolyAas）不同位置的60bp片段,插入pAlu14质粒（14个Alu正向串联插入pEGFP-C1）的GFP基因和Alu14之间,瞬时转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察和Northern检测,1F1R（PolyAas5′端第1个60bp片段）和4F4R（自PolyAas5′端计算第4个60bp片段）不能活化基因;2F2R和3F3R（PolyAas中间的2段）可以解除Alu14对GFP基因的抑制作用.将2F2R和3F3R各自反复首尾串联,分别插入pAlu14质粒GFP基因和Alu串联序列之间,瞬时转染HeLa细胞,用插入4个2F2R的pAlu28,插入4个3F3R的pAlu18,插入4个3F3R的pAlu28作长度对照,以排除由于插入片段长度增加可能对结果造成的干扰,发现2～4个拷贝的2F2R和3F3R活化基因作用高于一个拷贝的同样片段,但是多于8拷贝以后,活化GFP基因作用减弱.本实验证明,SV40 PolyAas至少含有两段活化基因序列,活化基因序列（2F2R,3F3R）的最适活化基因条件需要合适的拷贝数.     

The Chlamydomonas Chloroplast HLP Protein Is Required for Nucleoid Organization and Genome Maintenance

The chloroplasts genome （plastome） occurs at high copy numbers per cell. Several chloroplast genome copies are densely packed into nucleoprotein particles called nucleoids. How genome packaging occurs and which proteins organize chloroplast nucleoids are largely unknown. Here, we have analyzed the Chlamydornonas reinhardtii homolog of the bacterial architectural DNA-binding protein HU, the histone-like protein HLP. We show that the Chlarnydornonas HLP protein is targeted to chloroplasts and associates with nucleoids. Knockdown of HLP gene expression by RNA interference （RNAi） alters the structure of chloroplast nucleoids and appears to reduce the level of compaction of chloroplast DNA. Unexpectedly, also chloroplast genome copy numbers are significantly decreased in the RNAi strains, suggesting that, in addition to its architectural role in nucleoid formation, the HIP protein is also involved in chloroplast genome maintenance.     

基因组拷贝数变异研究进展

基因组结构变异分为两个层次:显微水平(microscopic)和亚显微水平(submicroscopic)。显微水平的基因组结构变异主要是指显微镜下可见的染色体畸变,包括整倍体或非整倍体、缺失、插入、倒位、易位、脆性位点等结构变异。亚显微水平的基因组结构变异是指DNA片段长度在1Kb-3Mb的基因组结构变异,包括缺失、插入、重复、重排、倒位、DNA拷贝数目变化(copy numbervariation,CNV),这些统称为CNV或者CNP(copy number polymorphisms,CNP)。对CNV的研究能够帮助研究者建立遗传检测假说,进而发现疾病易感基因,同时加深对表型变异的理解,为今后研究人类生物功能、进化、疾病奠定基础。本文主要从CNV的研究历史、分子机制、研究方法、研究意义等四个方面进行综述.。     

猪13号染色体上拷贝数变异区内基因信息发掘及遗传规律分析

拷贝数变异(Copy number variation, CNV)是染色体上发生的一种微结构变异, 已引起越来越多研究者的关注。本课题组前期已获得猪13号染色体上的32个CNV区域(CNV region, CNVR), 为了发掘CNVR内的基因信息, 文章在线检索了上述CNVR内的基因并进行基因本体(Gene Ontology)分析。结果共发现236个基因, 其中有注释基因169个, 主要参与蛋白质水解、细胞粘附、大分子降解等生物过程。为了探索这些基因拷贝数变异的遗传规律, 文章选择RCAN1(Regulators of calcineurin 1)基因为候选基因, 利用QPCR方法在莱芜猪群中检测了该基因的拷贝数, 并分析了CNV在莱芜猪3个家系中的遗传规律。结果表明, RCAN1基因在莱芜猪群体中存在拷贝数的缺失、重复现象, 其拷贝数变异的遗传规律符合孟德尔遗传方式。     

Taqman定量PCR技术检测基因编辑番茄中外源基因拷贝数体系的建立

近些年CRISPR/Cas9基因编辑技术已广泛应用于作物遗传育种中,经过拷贝数筛选得到的单拷贝基因编辑株系,可以进行遗传分离获得具有改良性状但不携带外源基因成分的非转基因植株,消除转基因安全性的风险。目前拷贝数的检测主要采用Southern杂交,但是该方法存在操作复杂,需要相对大量的植物材料等缺点,不能进行高通量的筛选。为建立简便高效的基因编辑番茄植株中外源基因拷贝数的检测体系,以内源性基因APX(抗坏血酸过氧化物酶基因)作为内参基因,外源性基因HPT(潮霉素磷酸转移酶基因)作为目的基因,利用Taqman法的实时荧光定量PCR技术,检测有12株PDS基因(八氢番茄红素脱氢酶基因)编辑番茄中外源抗性基因HPT的拷贝数为1,初步建立了一种检测基因编辑植株中外源基因整合拷贝数的方法,为快速可靠的筛选单拷贝改良株系奠定了一定的技术基础。     

水稻EPSP合酶cDNA克隆、序列分析及其拷贝数测定

根据本室分离的水稻EPSP合酶基因的基因组序列设计一对引物 ,利用RT_PCR方法首次从水稻 (Oryzasati vaL .subsp .indica)叶片的RNA中扩增获得了水稻编码EPSP合酶的全长为 15 85bp的cDNA片段 ,它含有一个完整的开放读码框 ,编码 5 11个氨基酸 ,包括 44 4个氨基酸组成的成熟肽序列以及N端的 6 7个氨基酸组成的叶绿体转运肽序列。成熟肽氨基酸序列对比表明 ,除真菌来源的EPSP合酶变异较大外 ,其他来源的EPSP合酶同源性较高 ,均在 5 1%以上。而叶绿体转运肽氨基酸序列同源性较低。Southern杂交表明水稻EPSP合酶基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在。RT_PCR分析表明 ,水稻EPSP合酶基因在根、未成熟种子和叶片中均有转录表达 ,在叶片中表达量最高     

有机磷抗性致倦库蚊种群中酯酶基因扩增的定量分析

致倦库蚊Culex qinquefasciatus是丝虫病的主要传染媒介。通过生物测定、单个蚊虫酯酶α2和β2基因拷贝数分析和酯酶β基因序列比较, 分析了抗性水平、抗性相关基因在种群中的分布及其基因拷贝数等的抗性分子特征。应用快速PCR仪（realtime quantitatIve PCRs）直接检测库蚊中酯酶基因和mRNA拷贝数。结果显示：上海致倦库蚊对对硫磷的抗性LC₅₀为8.12, 酯酶活性升高是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂产生抗性的主要机理。编码致倦库蚊酯酶β的氨基酸序列同编码尖音库蚊酯酶B1的氨基酸序列相比同源性为98%;同致倦库蚊酯酶B2氨基酸序列相比同源性为100%,同环蹶库蚊酯酶B3氨基酸序列相比同源性为90%, 上海致倦库蚊中酯酶α和β基因均扩增。有机磷抗性的上海和PellRR蚊虫种群中单个蚊虫酯酶α2 和β2定量基因拷贝数均不同,其同一蚊虫个体的酯酶α2 比酯酶β2基因的拷贝数高,但没有明显的规律性,酯酶结构基因的扩增是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂抗性的主要机理,估计在野外种群的杂合个体中存在多种调控机制。     

一种检测真核生物基因中重复序列拷贝数的快速步骤

重复序列组成了高等真核生物基因组的大部分。当比较有关种类的基因组时,所观察封的许多变化发生在重复部分。比较种之间的任何特定序列的难易程度取决于该基因组中的顺序结构。尤其是对Southern吸收杂交产生扩散的重复序列难以定量,然而这些可能又是特别重要的序列。 可以使这样的序列定量的一种方法是滤纸结合杂交,称槽-吸收(Slot-blotting) 。     

重复DNA顺序pRRD9在稻属中的拷贝数测定

本文应用狭缝印渍杂交方法,把水稻基因组总DNA和含水稻中度重复顺序片段的质粒(pRRD9)DNA分别转移到尼龙膜上形成狭缝印渍、然后用~(32)P标记的 pRRD9插入片段进行杂交、根据各狭缝印渍的放射性强度,测定水稻(Oryza)一些栽培种和野生种基因组中重复DNA顺序的拷贝数,并就拷贝数与水稻进化关系及基因组型的联系进行讨论.