几种杀虫药剂敏感蚊类酯酶多态性的研究

通过蚊虫酯酶蛋白的淀粉凝胶电泳分析和基因组DNA的限制性酶切片段长度多态性(RFLPs)比较, 对尖音库蚊Culex pipiens、三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus和中华按蚊Anopheles sinensis有机磷杀虫药剂敏感种群的酯酶蛋白和结构基因的多态性进行分析。发现在蛋白质水平上,三带喙库蚊敏感种群(n=54)在酯酶α和β位点分别存在2个和3个等位基因,在DNA水平上有2.9%的个体具有与酯酶β1¹基因1.3 kb Cdna片段同源的1.3 kb单拷贝带存在。发现中华按蚊敏感种群 (n= 50)中具有低活性的非特异性酯酶存在,在蛋白质水平上,酯酶α和β位点各有一个等位基因;在DNA水平上,通过对单个蚊虫基因组DNA的研究未发现有与酯酶β1¹基因同源的酯酶编码基因的存在。对尖音库蚊北京敏感种群(n= 64)的研究发现,在酯酶α和β位点都存在5个等位基因,在DNA水平上,使用一个限制性内切酶(EcoRI),15只蚊虫的样本在酯酶β位点发现了5个等位基因,说明在尖音库蚊北京敏感种群的酯酶β基因周围存在着较大的中性多态性,在有机磷杀虫剂的选择下,这些中性多态性可能会成为基因扩增的潜在因素。     

库蚊野生种群扩增等位基因重组现象分析

羧酸酯酶 (carboxylesterases)的过量产生是库蚊Culexpipiens对有机磷杀虫剂 (OP)产生抗性的主要机制。由est 3和est 2组成的酯酶超级基因座 (estersuper locus)的基因扩增是引起酯酶基因扩增的主要遗传学基础。通过淀粉电泳研究了采自广州、佛山、郑州的库蚊野生蚊虫种群 ,发现在这些种群中存在着扩增等位基因重组现象。该现象可能是蚊虫受到杀虫药剂的选择压力、等位基因多样性和等位基因型频率的影响。这将提供一个研究抗性进化的自然模型。     

不同地区尖音库蚊复合组抗药性的分子特征

通过生物测定、蛋白质电泳和单个蚊虫基因组Southern杂交三种方法对三个不同地区的尖音库蚊复合组蚊虫Culexpipienscomplex的抗性水平、抗性相关基因在种群中的分布及抗性分子特征进行了研究。采自山东高密、北京和云南昆明的尖音库蚊复合组蚊虫 4龄幼虫对敌敌畏、对硫磷 (有机磷类 )和仲丁威 (氨基甲酸酯类 )的抗性水平的测定结果表明 :与北京敏感系相比 ,高密种群对敌敌畏、对硫磷的抗性水平很高 ,北京种群对敌敌畏的抗性水平也很高 (约 30倍 ) ,三个种群对仲丁威的抗性与北京敏感系没有明显的区别。淀粉电泳的结果表明 :高密和北京种群中存在过量产生的非特异性酯酶Estβ11,昆明种群中存在过量产生的非特异性酯酶Estα2和Estβ2 ,单个蚊虫基因组Southern杂交的结果表明 :酯酶Estβ11、Estα2和Estβ2的结构基因发生了不同程度的扩增导致酯酶的过量产生     

不同地区尖音库蚊复合组抗药笥的分子特征

通过生物测定、蛋白质电泳和单个蚊虫基因组Southern杂交三种方法对三个不同地区的尖音库蚊复合组蚊虫Culex pipiens complex的抗性水平、抗性相关基因在处群中的分布及抗性分子特征进行了研究。采自山东高密、北京和云南昆明的尖音库蚊复合组蚊虫4龄幼虫对敌敌畏的抗性水平也很高（约30倍）,三个种群对仲丁威的抗性与北京第三系没有明显的区别。淀粉电泳的结果表明：高密和北京种群中存在过量产生的非特异性酯酶Estβ1^1,昆明种群中存在过量产生的非特异性酯酶Estα2和Estβ2,单个蚊虫基因组Southern杂交的结果表明：酯酶Estβ1^1、Estα2和Estβ2的结构基因发生了不同程度的扩增导致酯酶的过量产生。     

不同地区致倦库蚊种群相关酯酶 基因的特征分析

分别从广州、沙市、武汉近郊采集到致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus,对单只蚊虫进行淀粉凝胶电泳和Southern杂交方法的分析结果表明：3个实验种群中均分布有与抗性有关的高活性酯酶β1¹,酯酶α2/β2分布于广州实验种群中;广泛分布于地中海地区尖音库蚊Culex pipiens种群中的酯酶α4/β4、α5/β5在以上3个种群中均不存在。但是,在3个实验种群中均发现存在有一对新的高活性酯酶α8/β8,其电泳迁移率和限制性酶切片段均与目前已报道的几种高活性酯酶不同。含这两对新酯酶的蚊虫将应进一步从种群中纯化,纯合蚊虫新品系做分子特征的研究。     

杭州地区尖音库蚊复合组的抗药性动态

用生物测定和淀粉电泳技术对采自杭州市和上海市的尖音库蚊复合组(Culex pipienscomplex)蚊虫的抗性水平及与抗性有关的酯酶进行了研究。抗性水平的测定结果表明:与S-LAB敏感系相比,杭州市种群对DDVP、对硫磷、毒死蜱、邻仲丁基苯基甲基氨基甲酸酯和残杀威的抗性分别是S-LAB敏感品系的3.9,7.6,1.6,1.6,2.5倍。利用淀粉凝胶电泳技术分析了野生种群中抗性羧酸酯酶(EST)等位酶的基因表型及其频率。4个种群中都存在着世界范围内广泛分布的过量产生的非特异性酯酶Estβ1和Estα2/β2,上海种群主要以高活性的酯酶Estβ11为主(98.3%),除了这些基因以外,2004年杭州市下城区又出现了1种新的酯酶基因(50%)。     

不同地域有机磷杀虫药剂抗性库蚊复合组酯酶B1扩增的研究

在库蚊Culex pipiens品系中,非专一性酯酶的过量产生是对有机磷杀虫药剂抗性的普遍机理。酯酶基因位于紧密连锁的A和B座位上。现已知所有酯酶B的过量产生都是基因扩增的结果。为了确定不同国家库蚊品系的酯酶B1的过量产生是否都是相同DNA单基因型扩增的结果,我们构建了酯酶B1结构基因扩增区的限制性内切酶酶切图谱,分析了限制性酶切片段长度多态性(RFLP)。研究发现不同地理位置的酯酶B1库蚊,如法属圭亚那,委内瑞拉、波多黎各岛、美国加利福尼亚和中国北京,都有着相同的单基因扩增,但在扩增水平上有较大的差异。我们认为无论在美洲或亚洲,凡是酯酶B1扩增的库蚊都为同一个起源,之后经迁移而传播到各地;同时发现酯酶B1扩增的库蚊与酯酶A2一B2扩增的库蚊相比,其迁移有一定的局限性;并且酯酶B1扩增的库蚊仅仅限于美国、加勒比和中国的一些地区,而酯酶A2-B2扩增的库蚊则广泛地分布于美国、加勒比、亚洲、非洲、太平洋各岛及欧洲等地。     

一个致倦库蚊杀虫剂敏感品系的筛选

化学防治是控制蚊虫传播疾病的主要方法, 抗性监测表明我国蚊虫已对有机磷、 有机氯、 氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂产生了不同程度的抗性。蚊虫抗药性的分子机制主要包括靶标抗性和三大解毒酶家族带来的代谢抗性。筛选对杀虫剂敏感的品系是抗性监测和抗性机理研究必不可少的材料。本研究通过从一个致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus野生种群筛选无乙酰胆碱酯酶G119S突变且具有低活性羧酸酯酶、 P450单加氧酶和谷胱甘肽-S-转移酶的单雌系, 建立了一个对杀虫剂敏感的致倦库蚊品系。该品系的羧酸酯酶活性是敏感品系S-lab的2.5倍, P450单加氧酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性与S-lab相当。生物测定表明, 与S-lab相比, 该品系对有机磷杀虫剂有低于2倍的抗性, 对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂没有抗性, 可以作为相对敏感品系用于抗性监测。     

库蚊中抗性相关酯酶的研究进展

世界范围内普遍分布的库蚊是丝虫病的主要媒介,其存在极大地危害着人畜的健康。随着杀虫剂的广泛使用,该蚊抗性正日益增强;其中,非特异性酯酶活性升高是其对有机磷杀虫药剂（OP）产生抗性的主要机制。在尖音库蚊＠lexP巾lensfirm。。中,非特异性酯酶B活快升高是由于酯酶结构基因大量扩增,相应地大量表达酯酶而造成的（关于这方面的研究进展后振华先生1993年［’l就已作过综述）。本文仅介绍尖音库蚊抗性相关酯酶基因扩增研究方面的一些新进展。！与抗性相关的酯配基因应直到本世纪70年代末80年代初人们才发现尖音库蚊的酯酶活性升高…     

淡色库蚊酯酶等位基因及其在自然种群中的频率分布

酯酶基因扩增所产生的酯酶活性升高是库蚊Culex pipiens对有机磷杀虫剂抗性的主要机理之一。采用分子杂交技术和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析,已鉴定出多种酯酶等位基因类型。该文通过酯酶基因特异性片段的PCR扩增及扩增片段的酶切片段分析,对淡色库蚊Culex pipiens pallens四种有机磷抗性品系的酯酶等位基因进行分型,并测定分析自然种群中不同酶型的频率分布。研究结果表明：PCR分型方法具有快速、准确的特点。不同的有机磷杀虫剂对酯酶等位基因具有明显的选择作用。双硫磷品系为B₁型;毒死蜱和敌百虫品系为B₂型;马拉硫磷品系为B₁型和B₁/B₂杂合型。不同地区采集的种群表现出不同的酶型频率分布。该文就杀虫剂对酯酶等位基因选择作用及自然种群的酶型频率分布进行了讨论。     

淡色库蚊ATP合酶B亚基基因克隆和序列分析及其与溴氰菊酯抗性的关系

【目的】克隆淡色库蚊Culex pipiens pallens ATP合酶B亚基基因编码区序列,并进行生物信息学分析,研究其与溴氰菊酯抗性关系。【方法】通过PCR方法扩增ATP合酶B亚基基因编码区序列;利用生物信息学网站在线分析工具,预测ATP合酶B亚基基因编码蛋白的理化性质和功能特征;通过实时定量PCR方法比较ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊溴氰菊酯敏感品系和抗性品系中的表达,并在现场种群溴氰菊酯敏感和抗性个体中做进一步验证。【结果】成功克隆淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列(Gen Bank登录号:KY783434),长717 bp,编码238个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白理论相对分子量为26.96 k D,等电点为8.97,在第70-231位氨基酸具有ATP合酶B亚基结构域,未发现信号肽和跨膜区。实时定量PCR结果显示,ATP合酶B亚基基因在室内筛选的淡色库蚊抗溴氰菊酯品系和现场种群溴氰菊酯抗性个体中表达量均上调。【结论】本研究获得了淡色库蚊ATP合酶B亚基基因编码区序列,进行了生物信息学分析,并证实其在溴氰菊酯抗性个体中高表达,为进一步研究该基因在蚊抗药性中的作用奠定了基础。     

中美有机磷杀虫药剂抗性库蚊复合种群酯酶基因扩增的研究(英文)

用脉冲电场凝胶电泳技术,从北京和美国加州的有机磷杀虫药剂抗性库蚊复合品系中分离出一条49kb的酯酶基因扩增片段。该片段可能是一个完整的扩增单元,也是迄今分离出的最大的一条昆虫酯酶基因扩增片段,扩增基因结构的研究正在进行之中。本文还重点讨论了DNA大片段的制备方法和脉冲电场电泳分离技术。     

广东省三市致倦库蚊种群的抗性水平、非特异性酯酶分布频率及遗传分化

致卷库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)样本于2001年5月采自广州、佛山和中山。利用生物测定和淀粉凝胶电泳检测其对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性水平和抗性相关酯酶的分布频率。与北京敏感品系相比,3个种群对敌敌畏、对硫磷、仲丁威的抗性水平分别至少为21、8和5倍;以连锁形式存在的A8／B8和A9／B9是3种群主要的高活性酯酶,但A2／B2和B1有地区差异。由于种群间的基因流动,这些差异行将消失。     

淡色库蚊 (Culex pipiens pallens Coquillett)的抗性酯酶表现型及其在杀虫剂压力下的变化趋势(英文)

对来自杭州、临海和金华三个城市的淡色库蚊种群进行了抗性酯酶表现型频率分布的测定和分析 ,同时对三个种群进行双硫磷、敌百虫、毒死蜱和马拉硫磷等四种有机磷杀虫剂的抗性品系筛选 ,逐代测定和分析各种群在不同杀虫剂压力下 ,其抗性酯酶表现型频率分布的变化。结果表明 ,三个自然种群中都存在酯酶B1 、B2 纯合表现型及酯酶B1 /B2 杂合表现型 ,其中酯酶B1 纯合表现型占优势。各自然种群中的抗性酯酶表现型频率分布有差异。经过杀虫剂的逐代筛选 ,各种群相对于某一杀虫剂的压力 ,表现出选择较为单一的抗性酯酶表现型的趋势 :双硫磷有利于酯酶B1 纯合表现型的选择 ,敌百虫和毒死蜱有利于酯酶B2 纯合表现型的选择 ,马拉硫磷则似乎有利于酯酶B1 纯合表现型和酯酶B1 /B2 杂合表现型的选择 ,但酯酶B1 纯合表现型相对于B1 /B2 杂合表现型来说 ,对马拉硫磷抗性更强一些。根据研究结果 ,就蚊虫的抗性酯酶基因对不同杀虫剂的选择优势及相应的蚊媒控制策略进行了讨论。     

不同地理种群尖音库蚊复组抗性动态和遗传多样性

通过生物测定、蛋白质电泳和等位酶分析等方法对5个不同地区的尖音库蚊复组蚊虫Culex pipiens complex的抗性水平、种群中非特异性酯酶基因表型分布和种群遗传多样性进行了研究。不同地理种群的抗性检测结果表明：5个种群分别对敌敌畏、对硫磷、氯菊酯和溴氰菊酯的抗性较高,对残杀威、巴沙和胺菊酯的抗性较低;朝阳种群对敌敌畏抗性最高（55.7倍）,武汉种群次之;佛山种群对氯菊酯和溴氰菊酯的抗性比率高达123倍和23.9倍。酯酶电泳结果显示：5个种群间酯酶多态性存在差异,广州和佛山两个库蚊种群酯酶表型多态性最高,有B1,A2-B2,A8-B8,A9-B9,B10和A11-B11等6种酯酶表型,提示高活性酯酶是主要的抗性机制。群体遗传学研究表明：每位点平均等位基因数（A）为2.76,平均多态位点百分率（P）为64.45％,平均预期杂合度（He）为0.1943,种群间遗传分化系数（Fst）值为0.10,平均基因流(Nm)＝2.57,说明5个种群有较丰富的遗传多样性,种群内遗传多样性高于种群之间。据此推测,种群间可以通过迁徙等方式进行基因交流,使得遗传结构、抗性水平朝一致性方向变化。本研究对我国尖音库蚊复组蚊虫的综合治理有一定指导意义。     

昆虫学报2003年第46卷总目次

第 1期转Bt基因棉对非靶标害虫及害虫天敌种群动态的影响邓曙东 ,徐　静 ,张青文 ,周世文 ,徐冠军 (1)………………………………………………………………………………………………………………………一株苏云金杆菌噬菌体的形态结构及其蛋白质性质王卫国 ,孙富林 (6 )……………………………………有机磷抗性致倦库蚊种群中酯酶基因扩增的定量分析乔传令 ,J .HEMINGWAY ,李　 (11)……………小菜蛾对苦皮藤素抗性选育及交互抗性测定李二虎 ,吴文君 ,陈之浩 ,李凤良 ,李忠英 (18)……………光活化杀虫剂α 三噻吩的电子自旋共振分析…     

小菜蛾羧酸酯酶基因的克隆及其序列分析

利用CODEHOP设计简并引物,通过反转录多聚酶链式反应(RTPCR)克隆小菜蛾Plutellaxylostella抗性种群中抗性相关的羧酸酯酶基因,随机挑取测序5个阳性克隆进行测序,测序结果经过blastx比较,发现所获得的大约420bp的基因片断均为羧酸酯酶基因,与双翅目昆虫蚊子的氨基酸序列同源性达85%以上 。     

致倦库蚊Cecropin基因家族的比较和系统发育分析

利用生物信息学方法比较分析了致倦库蚊Cecropin家族4成员的基因结构、氨基酸序列、蛋白理化特性,预测蛋白空间结构,并基于7种昆虫绘制分子进化树,随后使用RT-PCR方法获取致倦库蚊Cecropin家族4成员的c DNA。结果表明:致倦库蚊Cecropin家族基因有两条正向编码,两条反向编码,长度为330~544 bp,由2个外显子和1个内含子构成;氨基酸序列长度为59~61 aa,具有两条基序和多个保守位点;编码的蛋白理论分子量为6 284.6~6 619.0 k D,p I值为10.36~11.24,亲水性平均系数为0.393~0.551;蛋白预测的二级结构和三级结构结果基本一致,它们具有1个信号肽结构域和1个催化结构域,结构域主要由α-螺旋构成;7种昆虫的Cecropin蛋白进化关系与物种进化关系基本一致,并以"目"或"亚目"为单位分别聚类,CPIJ005108与致倦库蚊Cecropin祖先基因最相似。本研究的分析结果可为蚊科Cecropin结构和功能的研究提供有价值的信息。     

蓝舌病毒血清5型毒株S7基因编码区的分子克隆与序列分析

目的:对蓝舌病毒(BTV)血清5型毒株(BTV-5)的S7基因编码区(ORF)进行克隆和序列分析。方法:用TRIzol LS试剂提取病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增BTV-5型毒株S7基因的编码区,将扩增片段克隆到pGEM-T Easy载体上,对阳性克隆进行核苷酸序列测定;采用DNAStar和DNASIS v2.5软件对环状病毒属不同种群的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列进行同源性及系统进化树分析。结果:克隆的基因片段长1050bp,为S7基因开放性读码框的全长序列,编码349个氨基酸残基;与环状病毒属不同血清型毒株比较,核酸序列同源性范围为42.2%～96.6%,推导的氨基酸序列同源性范围为40.4%～99.7%。结论:蓝舌病毒与非洲马瘟病毒、鹿流行性出血热病毒分属于不同种群,群内不同血清型的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列显示出很高的同源性,而不同种群之间的同源性很低。     

被动迁移在抗性进化中的作用

为了明确迁移和基因交流在杀虫剂抗性基因进化中的作用,我们从四个不同的地区采集有机磷抗性的库蚊野生种群,利用淀粉电泳鉴定了各种群中存在的已知过量产生酯酶的分布频率,并通过5个假定的中性位点的电泳多态性分析了种群间的遗传多样性。结果表明种群间的基因交流是存在的,遗传分化与地理位置存在一定关系,而抗性等位基因A2一B2的分布却与种群间的遗传分化不一致。对这种差异的解释是：被动迁移(铁路运输等)加速了抗性基因的交流,而当抗性基因以自然迁飞的方式向周围地区扩散时,却是一个相对缓慢的过程。