受miRNA-205调控的重组柯萨奇病毒B3的构建及其复制

本研究在柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)基因组P1编码区与P2编码区之间插入一段has-miRNA-205-3p和has-miRNA-205-5p(简称miR-205)的靶序列,得到重组病毒v205T,并比较分析了它在人宫颈癌细胞系HeLa细胞(miR-205低水平表达)和非小细胞肺癌细胞系A549细胞(miR-205高水平表达)中的复制情况。结果表明,插入的miR-205靶序列不影响病毒在HeLa细胞中的复制水平,但抑制了病毒在A549细胞中的复制,病毒滴度为对照的1%以下。为探讨v205T在2株细胞中复制差异的原因,进一步加入miR-205的类似物和抑制物。miR-205类似物可抑制v205T在HeLa细胞中复制和杀伤细胞的水平,而miR-205抑制物可提高v205T在A549细胞中的复制和杀伤细胞的水平。结果表明,v205T的复制确实受miR-205的调控。本研究为开发基于CVB3载体的溶瘤病毒和针对CVB3的减毒活疫苗提供了依据。     

不同剂量乌司他丁联合阿拓莫兰对感染性休克患者氧化应激、炎症反应及预后的影响

目的:探讨不同剂量乌司他丁联合阿拓莫兰对感染性休克患者血清氧化应激、炎症反应以及预后的影响。方法:选择2014年5月至2018年6月我院诊治的100例感染性休克患者,按随机数字表法分为乌司他丁组(乌司他丁20万U/d)、阿拓莫兰组(阿拓莫兰1.8 g/d)、低剂量联合组(乌司他丁20万U/d+阿拓莫兰1.8 g/d)、高剂量联合组(乌司他丁40万U/d+阿拓莫兰1.8g/d),每组各25例。对比四组患者治疗前后的血清氧化应激指标[丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋白产物(AOPP),超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]、炎症反应指标[白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)]的变化,并对比四组患者预后的差异。结果:高剂量联合组患者ICU住院时间、机械通气时间、治疗后急性生理与慢性健康量表(APACHEⅡ)评分、序贯器官衰竭(SOFA)评分、血清MDA、AOPP、IL-6、TNF-α、PCT、CRP水平均低于乌司他丁组、阿拓莫兰组、低剂量联合组,低剂量联合组低于乌司他丁组、阿拓莫兰组(P0.05)。高剂量联合组治疗后血清SOD、T-AOC、GSH-Px高于乌司他丁组、阿拓莫兰组、低剂量联合组,低剂量联合组高于乌司他丁组、阿拓莫兰组(P0.05)。高剂量联合组、低剂量联合组患者多器官功能障碍(MODS)发生率和死亡发生率均低于乌司他丁组、阿拓莫兰组(P0.05)。结论:乌司他丁联合阿拓莫兰治疗感染性休克效果显著,可有效抑制全身氧化应激和炎性反应,改善患者预后,且高剂量乌司他丁联合阿拓莫兰治疗感染性休克的效果最优。     

宿主因子莫罗尼白血病病毒10蛋白抑制异嗜性鼠白血病病毒相关病毒的复制

本研究探讨宿主因子莫罗尼白血病病毒10(Moloney leukemia virus 10MOV 10)蛋白对异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virusis,XMRV)复制的抑制作用,以及MOV 10抑制XMRV复制的初步机制和关键结构域。通过转染、感染、免疫印迹(Western blotting)及实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测MOV10对XMRV的抑制作用及机制,结果显示MOV 10可明显抑制XMRV,并且这种抑制作用具有特异性。经进一步证实,MOV 10包裹进XMRV病毒中,随之在病毒感染细胞时发挥抑制作用;MOV 10可以抑制XMRV的DNA产生;MOV 10发挥抑制作用的关键结构域是MOV 10本身RNA解旋酶的7个保守结构域。以上的研究结果表明MOV 10对XMRV具有明显的抑制作用,初步阐明了MOV 10抑制XMRV复制的机制,明确了MOV 10发挥抑制作用的关键结构域。本研究进一步证实了MOV 10具有广谱的抗逆转录病毒的活性,在宿主对抗逆转录病毒感染时发挥重要作用。     

型内嵌合口蹄疫病毒全长感染性cDNA克隆的构建

【目的】近年来,O型口蹄疫的不断暴发严重危害了我国畜牧业的发展,其病原——O型口蹄疫病毒已演化出3种谱系:中国型猪毒系、泛亚系和缅甸98系。其中中国型猪毒系病毒高度嗜猪,对养猪业危害最大。目前应用的疫苗已不能有效保护中国型猪毒系变异株的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,用流行的新猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因(主要是替换VP1蛋白上的B-C环和G-H环)替换疫苗毒株的相应部分,构建了嵌合的FMDV全长cDNA克隆。【方法】线化的嵌合全长质粒和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,体内转录拯救嵌合病毒。【结果】嵌合全长质粒转染BHK-21细胞36h后,出现明显的FMDV致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察结果证实成功拯救到嵌合的FMDV。拯救的病毒乳鼠致病性试验结果表明该拯救病毒对乳鼠的致病力减弱。该嵌合病毒的成功拯救为研制口蹄疫新型疫苗等奠定了基础。     

犬完整骨及骨水泥重建骨缺损微波灭活后的生物力学研究

目的:研究微波消融(microwave ablation)对结构正常及缺损后骨水泥修复重建的犬骨生物力学性能的影响.方法:取成年犬股骨12对,随机分为完整组和重建组,再随机选取每对股骨的一侧作为对照组,另一侧为实验组,试验由此分为四组:完整对照组,完整微波组,重建对照组,重建微波组.然后将每根股骨制作成两个不同的骨标本,分别长3 cm和6 cm.两种微波组的标本均进行微波灭活,两种重建组的标本均制备成缺损模型并行骨水泥修复重建.然后分别对3、6 cm两种标本行压缩和三点弯曲试验.结果:完整对照组与完整微波组之间,重建对照组与重建微波组之间的最大压缩力、最大压缩位移、最大弯曲力及最大挠度等均无显著性差异.结论:微波消融对结构正常的犬骨的生物力学性能无明显影响,且不会加剧对重建犬骨的力学强度的破坏.     

真菌几丁质合酶的研究进展

真菌细胞壁几丁质的合成是一个复杂的过程,其关键酶为几丁质合酶(CS).近年来,丝状真菌中的CS研究有了大的突破,与酿酒酵母中只有3种CS不同,丝状真菌中存在7种类别的CS.大部分临床和农业中重要的病原真菌都是丝状真菌,文中对真菌中7种类别CS的结构和功能作了概述,重点讨论了丝状真菌中重要的CS类别,并介绍了CS作为抗真菌药物有效靶标的研究现状,旨在为研究真菌CS及其抑制剂提供参考.     

特异性标记EIAV感染性克隆的构建及鉴定

用FLAG^TM或6His对EIAV疫苗株全基因感染性克隆pFD3的S2分子进行分子标记,以建立EIAV疫苗株与野毒株感染鉴别诊断的方法。标记产物pFD3-FLAG和pFD3-HISADD转染驴胎皮细胞(FDD)后收获衍生病毒并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性。在FDD细胞上盲传至第五代后收获细胞培养上清再感染驴单核巨噬细胞(DL),盲传三代后pFD3-FLAGRT酶活性显示弱阳性,未见明显的细胞病变;pFD3-HISADD为强阳性,且细胞病变效应明显,在电镜下可见明显的病毒颗粒。与父本克隆pFD3相比,在细胞水平上二者复制特性有明显的不同。证明在DL细胞上S2基因的完整性是病毒复制很重要的因素。     

逆向突变型EIAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆 pLGFD3 8的基础上,按照疫苗制作过程中 EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造。并在gag突变的基础上增加env 突变位点。将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和 RT PCR方法验证其感染性。结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到 RT酶活性和 RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的病毒颗粒。然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度。驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后。此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础。     

嵌合型HCV全长cDNA的构建及体外转录制备感染性RNA的研究

构建HCV la/1b嵌合型全长cDNA克隆,进行体外转录,脂质体法转染HepG2细胞,以RT-PCR法检测HCV正、负链RNA,Western印迹检测HCV蛋白表达.结果表明,细胞在转染后8代(约35d)内,能间断检测到HCV正、负链RNA以及相对分子质量约70000的HCV NS3蛋白,证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达.本研究表明含有该嵌合型全长cDNA的质粒可以为后续HCV的研究提供大量可重复的性质均一的病毒模板,有助于深入了解HCV的复制机制.     

J亚群白血病病毒NX0101株感染性克隆化病毒的构建及其致病性

采用PCR方法分3段扩增出J亚群白血病病毒NX0 10 1株的前病毒cDNA ,PCR产物经克隆后顺次连接,获得一个含有完整ALV J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pALV J NX。将此质粒DNA纯化后转染鸡胚成纤维细胞,以针对ALV J的单克隆抗体JE9对转染后的细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有感染性的病毒。测定原始野毒和分子克隆化病毒的半数组织感染量(TCID50 ) ,分别人工接种1日龄商品代肉鸡并隔离饲养17周。接种野毒组死亡率为2 6 % ,髓细胞瘤发病率为2 4 %。接种分子克隆化病毒组死亡率为2 2 % ,髓细胞瘤发病率为2 2 %。结果表明,克隆化病毒具有天然病毒的致病性并对肉用型鸡表现致瘤性