利用流式细胞术测定CTL活性方法在EIAV免疫学中的应用

利用PKH 26和CFSE两种荧光染料对靶细胞染色,建立了一种通过流式细胞术进行马传染性贫血症病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)反应的新方法,避免了经典的Cr51释放法对检测人员的放射线威胁,降低了本底释放,提高了检测的灵敏度.将该检测方法用于检测EIAV疫苗毒接种马和嵌合克隆接种马的细胞免疫反应变化趋势,数据显示细胞免疫反应在接种后3个月达到成熟阶段而后保持在较高的反应水平.该方法的成功建立和应用为研究EIAV减毒疫苗的免疫机制提供了好的研究手段,也为其他病毒的免疫学研究提供了新的参考方法.     

HIV-1超感染的研究进展

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus,HIV)超感染(Superinfection)的案例在近两年被陆续报道,到目前共有5个超感染的病例被确定[1～4].     

利用流式细胞术测定CTL活性方法在EIAV免疫学中的应用

利用PKH-26和CFSE两种荧光染料对靶细胞染色,建立了一种通过流式细胞术进行马传染性贫血症病毒 (Equine infectious anemia virus,EIAV)抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)反应的 新方法,避免了经典的Cr51释放法对检测人员的放射线威胁,降低了本底释放,提高了检测的灵敏度。将该检测方 法用于检测EIAV疫苗毒接种马和嵌合克隆接种马的细胞免疫反应变化趋势,数据显示细胞免疫反应在接种后3 个月达到成熟阶段而后保持在较高的反应水平。该方法的成功建立和应用为研究EIAV减毒疫苗的免疫机制提 供了好的研究手段,也为其他病毒的免疫学研究提供了新的参考方法。     

逆向突变型EIAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆 pLGFD3 8的基础上,按照疫苗制作过程中 EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造。并在gag突变的基础上增加env 突变位点。将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和 RT PCR方法验证其感染性。结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到 RT酶活性和 RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的病毒颗粒。然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度。驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后。此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础。     

逆向突变型EIAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆pLGFD3-8的基础上,按照疫苗制作过程中EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造.并在gag突变的基础上增加env突变位点.将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和RT-PCR方法验证其感染性.结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性.电镜下可见大量典型的病毒颗粒.然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度.驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后.此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础.     

特异性标记EIAV感染性克隆的构建及鉴定

用FLAGTM或6 His对EIAV疫苗株全基因感染性克隆pFD3的S2分子进行分子标记,以建立EIAV疫苗株与野毒株感染鉴别诊断的方法.标记产物pFD3-FLAG和pFD3-HISADD转染驴胎皮细胞 (FDD)后收获衍生病毒并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性. 在FDD细胞上盲传至第五代后收获细胞培养上清再感染驴单核巨噬细胞 (DL),盲传三代后pFD3-FLAG RT酶活性显示弱阳性,未见明显的细胞病变;pFD3-HISADD为强阳性,且细胞病变效应明显,在电镜下可见明显的病毒颗粒.与父本克隆pFD3相比,在细胞水平上二者复制特性有明显的不同.证明在DL细胞上S2基因的完整性是病毒复制很重要的因素.