中国河北省卢龙地区猪札如病毒的基因多样性

Porcine sapoviruses (SaVs),which belong to the family Caliciviridae,have been considered potential zoonotic agents for human infection,and several cases have been reported in Asian countries. In this study,a total of 200 porcine fecal samples collected from Lulong county of China were tested. Among 200 samples,porcine sapoviruses were detected by RT-PCR in 17 samples (8.5%) showing their circulation in China. 14 out of 17 positive sapovirus strains were genetically related to the genogroup III (GIII) and we...     

猪脂肪前体细胞分化过程中聚脂相关基因的表达模式

本实验采用胶原酶消化法分离猪皮下脂肪前体细胞,用含850 nmol/L 胰岛素和50 nmol/L地塞米松的诱导培养液进行诱导,采用油红O提取法测定了细胞中的甘油三酯含量,同时采用实时定量RT-PCR方法检测了细胞分化过程中聚脂相关基因的表达.结果显示:转录因子PPAR γ和C/EBP β在诱导后12 h即迅速表达,SREBP-1 mRNA表达水平在诱导后12 h出现显著下调,随后逐渐升高,96 h达到最高水平;脂肪合成相关酶基因GPDH、FAS、ACC和LPL呈现出与SREBP-1相似的表达模式;脂肪酸转运相关基因aP2、FAT、FATP1与VLDLR的表达量随着细胞分化过程的延长而不断增加,并且与细胞内甘油三酯的含量变化高度相关.本实验结果表明,PPAR γ、C/EBP β和SREBP-1可能是调控猪脂肪前体细胞分化的关键转录因子.猪皮下脂肪组织在聚脂过程中,在分化早期可能以脂肪细胞自身合成脂肪酸为主,而后期则主要依赖细胞外脂肪酸的跨膜转运.这些结果可能有助于揭示脂肪细胞的分化调控规律.     

烟酰胺在原代培养的猪前体脂肪细胞增殖分化中的作用

为研究烟酰胺(Nicotinamide,NAM)在原代培养的猪前体脂肪细胞增殖分化中的作用,探讨其作用的分子机制,用不同浓度(0-500μmol/L)的NAM处理猪前体脂肪细胞。MTT和油红O染色及提取法检测结果表明:在不同的作用时间内,与对照组相比,100-500μmol/L的NAM均可以促进猪前体脂肪细胞的增殖分化,随着NAM浓度的增加,其对前体脂肪细胞增殖分化的促进作用逐渐上升,当浓度为300μmol/L时达到高峰,即300μmol/L NAM的促进效果最为显著(P<0.05);随后,400和500μmol/L NAM的促进作用逐渐减弱。RT-PCR法分析结果表明,Sirt1 mRNA表达显著下降(P<0.05),而其靶基因FoxO1和脂肪细胞分化标志基因PPARγ2、C/EBPα mRNA表达量明显升高(P<0.01),aP2和LPL表达也显著增加(P<0.05)。表明NAM是Sirt1的一个有效抑制剂,它可能通过抑制Sirt1的表达来促进猪前体脂肪细胞增殖和分化。     

猪卵母细胞c-mos基因表达以及RNA干扰

c-mos基因在动物卵母细胞减数分裂调控中起作用,但其作用机制目前仍不清楚。本实验通过RT-PCR、免疫荧光激光共聚焦检测方法检测了猪卵母细胞在体外成熟培养过程中c-mos基因在转录水平、翻译水平上的表达以及蛋白的分布,并应用注射小干扰RNA(siRNA)方法对其进行了RNA干扰(RNAi)研究。结果显示,猪卵母细胞在体外成熟培养过程中c-mos基因mRNA量逐渐增高,电激活后6h接近完全降解;MOS(c-mos基因蛋白产物)在GV卵母细胞生发泡中有一定量的表达,生发泡破裂(GVBD)前表达量增加且开始向卵母细胞胞质弥散,成熟培养44h未成熟卵母细胞中的MOS表达量要高于成熟卵母细胞,激活后6h核区MOS明显减少,但仍然有少量MOS分布于胞质中;成熟培养前干扰c-mos基因,所用三个siRNA都能成功敲低mRNA量,分别是同时期对照组mRNA量的0.08±0.03,0.11±0.06和0.20±0.06倍,干扰后虽然没有完全剔除MOS,但MOS量比同期卵母细胞有明显下降,仍可以引发成熟卵母细胞染色体解凝集。研究结果揭示了猪卵母细胞体外成熟及发育进程中c-mos基因在转录和翻译水平上的动态表达规律,建立了猪卵母细胞c-mos基因RNAi体系,为MOS在猪卵母细胞发育过程中的功能研究建立了重要的基础。     

猪激素敏感脂肪酶基因外显子1的遗传多态性分析

采用PCR-SSCP方法检测猪激素敏感脂肪酶（hormone sensitive lipase,HSL）基因外显子1的多态性,并分析其与初生重、断奶重、6月龄重和背膘厚的关联性。根据猪HSL基因的DNA序列（AJ000483）设计5对引物,结果在P5引物对扩增的片段上发现了多态性,并对纯合子进行测序,发现外显子1的874bp处存在G-A转换,且存在3种基因型（AA、AB、BB）。统计结果表明,3种基因型在各品种中的分布不一致,长白猪和大白猪与莱芜猪和沂蒙黑猪比较差异极显著（P〈0．01）,长白猪与大白猪比较,莱芜猪与沂蒙黑猪比较差异均不显著（P〉0．05）。固定效应模型分析结果表明,背膘厚基因型间差异显著（P〈0．05）,而初生重、断奶重和6月龄重基因型间差异均不显著（P〉0．05）。最小二乘分析结果表明,BB基因型个体同AB和AA基因型个体比较背膘厚的差异显著（P〈0．05）,3种基因型在背膘厚的大小排列顺序为BB〈AB〈AA。因此,推测HSL基因对个体胴体瘦肉率存在一定的影响将HSL某因应用于猪育种过程中的标记辅助选择可以加快猪的育种进程。     

猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪（BaMei）肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokine signaling -2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明：首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列（GenBank登录号为EF121242）,其长度为822 bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。     

Spindle-view系统在猪卵母细胞去核中的应用

应用Spindle-view对体外成熟培养36、42、44和48h的猪体外成熟卵母细胞减数分裂纺锤体进行去核操作,并与传统去核方法(McGrath-Solter去核法,挤压去核法)相比较,结果表明:①在42~48h之间利用Spindle-view得到的猪卵纺锤体影像与极体的相对位置没有明显的变化;②Spindle-view适合用于猪体外成熟卵母细胞减数分裂纺锤体的观察及去核;去核效率与其他两种方法相比差异极显著(95.5%,42.1%,74.2%,P<0.01);③纺锤体成像是否清晰可用于猪卵母细胞的质量监控。     

猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有猪γ-干扰素(porcine interferon-γ,PoIFN-γ)完整开放阅读框的供体质粒pFastBacTM1-PoIFN-γ,转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-PoIFN-γ,转染sf9昆虫细胞救获表达PoIFN-γ的重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ。以抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗进行Western blot、间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,结果表明PoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ感染的昆虫细胞中获得正确表达。抗病毒活性试验显示,重组杆状病毒表达rPoIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在猪肾细胞系(PK-15)的复制,rBac-PoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清抗病毒活性为2×104抑制单位(IU)/mL,其抗病毒活性可以被鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清有效阻断。结果表明rPoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ在感染昆虫细胞获得有效表达,并具有高效抗病毒活性。     

猪Fas基因的克隆及序列分析

广西大学动物科技学院李军、李晓宁、杨坚和罗建荣四位科研工作者从pk-15细胞中提取总RNA,用RT—PCR方法扩增出猪Fas基因,将其克隆到PMD18-T载体上,再进行序列分析,结果表明：克隆的猪Fas基因序列与genBank上登录的猪Fas基因同源性为100％,与人、牛、羊的Fas基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73．4％、79．2％、76．4％和56．2％、67．0％、64．6％。Fas蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、牛、羊与人的基因中呈现较高的同源性。[第一段]     

小型猪与梅山猪Prop1基因的比较分析

Prop1是一种新发现的参与早期胚胎垂体发育的特异性转录因子。在人和动物均已发现由于该基因突变而引起的综合性垂体功能障碍,进而影响生长和繁殖。小型猪与梅山猪比较,其繁殖力和生长性能差异显著,为了了解这些差异的遗传基础,本试验对五指山猪、藏猪和版纳猪三种小型猪的Prop1基因进行克隆测序,并与已知梅山猪的序列进行对比,结果为:五指山猪与藏猪外显子1第69位发生G-A碱基替换,编码同义氨基酸;藏猪外显子2第115位发生A-G碱基替换,编码终止密码子;藏猪与版纳猪外显子3第466位和第631位均发生C-T碱基替换,第466位藏猪编码同义氨基酸;第631位版纳猪编码丝氨酸(TCC),梅山猪编码脯氨酸(CCC),即两种猪的Prop1基因产物不同。在Prop1基因终止密码下游250左右有一个腺苷酸丰富区,五指山猪与藏猪有15个腺苷酸串联,版纳猪有12个。上述结果为进一步研究大猪和小型猪之间生产性能差异的遗传基础提供了新线索。