小鼠超数排卵优化试验方案研究

探讨建立一种适合贵州地区、高效、稳定的小鼠超数排卵优化方案。在饲养环境相同的基础上,对激素(PMSG, hCG)不同的剂量组合、注射间隔时间、小鼠周龄等影响因素进行了相关研究。试验结果表明:(1)平均采胚数量组间、平均异常胚组间与平均可用胚组间差异显著(p<0.05),注射10 IU的激素剂量组合获得受精卵最多,且异常胚最少,效果最佳。(2)第1、第2、第3组平均采胚数量组间差异显著(p<0.05),第1组与第2组平均可用胚组间差异不显著(p>0.05),但第1、2组与第3组差异显著(p<0.05),异常胚组间差异不显著(p>0.05),选择4周龄超排效果最佳。(3)第1、第2、第3组平均采胚数量、平均可用胚组间差异显著(p<0.05),平均异常胚组间差异不显著(p>0.05),PMSG,hCG间隔注射时间为48 h为最佳。     

组蛋白修饰对酿酒酵母复制起始相关蛋白基因表达的调控

真核生物的DNA复制是一个复杂且有序的过程,其中DNA复制起始参与调控众多生物学活动,对生物正常的生长发育具有重要作用。组蛋白修饰在调节DNA复制过程中具有重要作用。为了检测组蛋白特定位点的修饰对DNA复制起始的影响,本研究以酿酒酵母组蛋白H3/H4定点突变菌株为研究对象,采用倍比稀释表型分析法检测了组蛋白11种H3/H4甲基化、乙酰化突变菌株的生长情况,显示,以野生型菌株BY4741为对照,组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K64A、H3K56A、H3K14Q、H4K5R、H4K16Q以及组蛋白H4甲基化突变菌株H4K20Q表现为生长缺陷,其他菌株与BY4741生长情况基本一致;通过GeNorm和NormFinder软件分析得出本实验最适内参基因为β-actin;采用Real-time PCR检测了菌株细胞内复制起始相关蛋白基因mcm2、mcm10、cdc45的表达情况,表明,组蛋白H3/H4甲基化突变菌株H3K9A、H3R72K、H4K59A、H4K20Q胞内mcm2、mcm10、cdc45基因表达均显著下调(p0.01),而H4R3A胞内mcm2、mcm10表达显著上调(p0.05)、cdc45显著下调(p0.01),组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K14Q、H4K5R、H4K8A、H4K16Q胞内mcm2表达显著下调(p0.01),而在H3K64A、H3K56A胞内无显著变化,mcm10在6种组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株内表达均下调(p0.01),cdc45基因在H4K5R胞内表达无显著变化,在其余5种乙酰化突变菌株中表达均显著下调(p0.01),为进一步阐明组蛋白特定位点修饰调控DNA复制起始的深入研究提供理论帮助。     

脊椎动物FoxO基因亚族的进化

本研究以脊椎动物FoxO作为研究对象,选取NCBI上公布的多个FoxO基因编码蛋白的核苷酸序列,重点分析Fox O蛋白质结构和功能的相似性与差异性,重建FoxO基因的系统发育树并进行选择压力分析,对FoxO基因亚族的起源和进化进行研究分析。结果显示:脊椎动物FoxO蛋白间Forhead结构域十分保守但核定位信号区结构差异较明显,尤其是FoxO6蛋白,并且多个磷酸化位点在哺乳动物FoxO6中缺失,削弱核输出信号,但在斑马鱼和原鸡的FoxO6中未缺失这些位点,推测其胞质定位调控作用仍十分重要。FoxO3中多个磷酸化位点可能与寿命延长作用相关。系统发育树表明FoxO1是FoxO基因的祖先基因,不同FoxO基因进化速率不同。选择压力分析结果显示FoxO基因过程每个位点经历不同的选择压,并且获得25个正选择位点,这些正选择位点可能对FoxO不同基因的形成和新功能的产生中具有十分重要的作用。     

PD-L1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的 程序性死亡配体-1(PD-L1)是免疫调节途径的重要因子,是抗肿瘤免疫疗法中重要的靶标之一。利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法 构建Cas9和sgRNA载体,并转录获得RNA,通过显微注射方式将RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经过鉴定获得F₀代阳性小鼠。F₀代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配获得F₁代杂合子小鼠,再通过F₁代小鼠自交获得F₂代纯合子小鼠品系。随后通过Real-Time PCR和流式实验分别检测PD-L1基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果 Real-Time PCR和流式实验检测结果显示与野生型C57小鼠相比,PD-L1纯合子小鼠的PD-L1 mRNA相对表达水平和细胞上的蛋白质表达均有显著性下降,仅测定到本底的信号,证实已成功构建PD-L1基因敲除小鼠品系,为PD-L1体内基因功能研究提供了新的小鼠模型。     

人源抗体制备及临床应用研究进展

与常规治疗药物相比,抗体药物具有靶向性强、特异性好等优点,其作为一类重要的治疗性药物,近年来在临床中的应用逐渐增多,为疾病的治疗提供了新的选择,应用范围逐渐从肿瘤、自身免疫性疾病及慢性炎症扩展到心血管和感染性等疾病中。人源抗体的全部结构是由人类抗体基因所编码的,因此避免了异种蛋白长期应用引起的不良反应,加之人源抗体制备技术的不断发展完善,使其逐渐成为治疗性抗体研发的首要选择。综述了近年来治疗性人源抗体的主要制备技术及其在临床中应用的最新进展,同时探讨了人源抗体制备技术的不足之处,以期为人源抗体的发展提供借鉴和思路。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

宁夏水稻代表性种质及后代抗稻瘟病基因型分析北大核心CSCD

以96份宁夏水稻代表性种质资源和47份杂交后代为试验材料,采用宁夏稻瘟病菌生理小种人工接种和自然诱发相结合的方法对其进行稻瘟病抗性的大田鉴定和病圃鉴定,评价了每个材料的稻瘟病抗性;同时采用8个主效抗稻瘟病基因的功能标记对上述材料进行抗病基因的分子检测,得到了28个不同的抗稻瘟病基因型,将不同基因型的稻瘟病抗性评价进行了差异显著性分析。结果表明,同时含有Pita、Pib、Pikm、Pikh、Pi9和Pi5共6个抗病基因组成的基因型的水稻材料对稻瘟病的抗性极显著高于其他基因型的抗性。Pita基因单独与Pikm、Pikh、Pi2、Pi5基因聚合时均表现出正向聚合效应,其中Pita与Pikh基因的聚合效应最强。当Pib与Pita+Pikh聚合时,表现出负向聚合效应。这为宁夏地区通过基因聚合方法选育广谱持久抗稻瘟病水稻新品种提供了重要的参考依据。     

紫花苜蓿F-box蛋白基因MsFTL的克隆及功能分析

FTL(F-box Triple LRR protein)是F-box蛋白家族的成员,具有F-box保守结构域,在植物抵御逆境胁迫过程中起重要作用。本研究参考低温胁迫下紫花苜蓿转录组数据设计引物,通过RT-PCR克隆获得紫花苜蓿MsFTL基因,该基因的全长1422 bp,编码473个氨基酸。该蛋白含有1个F-box结构域及3个LRR重复。系统进化分析表明,MsFTL与蒺藜苜蓿XP_003626345.1 F-box/FBD/LRR-repeat protein亲缘关系最近。两者蛋白序列比对发现共有11个差异位点。在低温、盐、干旱以及外源ABA处理下,MsFTL基因受到诱导,表达量上调。构建植物过表达载体pCBM-MsFTL,通过农杆菌介导法转化烟草。对经过抗性筛选、PCR和Real-time PCR验证的转基因植株进行低温抗性鉴定。在-4℃低温胁迫下,野生型烟草叶片出现了明显的萎蔫失水现象,而转基因烟草萎蔫程度相对较轻。生理检测结果表明,4℃处理24 h之后,转基因烟草的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、SOD活性,CAT活性高于野生型,MDA含量低于野生型。本研究表明,MsFTL基因在提高植物对低温胁迫的抗性方面具有重要的作用。     

花椰菜BobACT基因的克隆及其作为内参基因的研究

实时荧光定量PCR技术是探索植物基因功能和调节机理的有效手段。选择合适的内参基因是获得实时荧光定量PCR准确性数据的必备条件。ACT基因高度保守且表达稳定,常作为内参基因被广泛应用。为了获得花椰菜ACT基因,以转录组测序和RT-PCR方法为手段克隆得到花椰菜肌动蛋白基因Actin。该基因等电点为5.395,理论分子量为41.77 kD;其cDNA开放阅读框长1134 bp,编码氨基酸377个,GenBank登录号为MG598643。Wolf Psort分析发现,BobActin蛋白亚细胞定位于细胞质基质中。Motif Scan分析显示,BobActin蛋白质的氨基酸序列4～377位为Actin保守结构域。进化分析表明,同源序列基因编码的蛋白质与同为十字花科的甘蓝、芜菁和油菜同源蛋白的相似性达到90%以上,具有高度的保守性。在此基础上,设计了1对荧光定量PCR引物,分析显示,该引物具有较高的特异性和扩增效率,在花椰菜根、茎、花、花球、叶片等不同组织和低温、高温、盐处理、干旱处理、ABA处理等胁迫处理下均能稳定表达,适合在花椰菜基因表达研究中作为内参基因,为开展花椰菜重要功能基因的挖掘、表达模式以及调控机理的研究提供参考。花椰菜在内参基因方面的研究还处于初步阶段,今后可继续克隆其他内参基因,丰富花椰菜的内参基因库,从而进一步提高花椰菜基因表达分析研究的稳定性、重复性和准确性。     

FGF-21抑制HSC-T6细胞活化的抗肝纤维化作用及其机制的研究

目的:探索成纤维细胞生长因子21(FGF-21)对肝星形细胞T6(HSC-T6)活化的作用及其作用机制。方法:1640+10%胎牛血清的培养基培养HSC-T6细胞,实验分为5组:正常对照组(Control)、模型组(Model 20 m M乙醇处理细胞12 h)、低剂量FGF-21组(LFGF-21,0.5μmol/L)、中剂量FGF-21组(MFGF-21,1.0μmol/L)和高剂量FGF-21组(HFGF-21,2.0μmol/L)。Real-time PCR检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)和Notch2的m RNA水平,Western blot检测CollagenⅠ、α-SMA、MMP2、MMP9和Notch2的蛋白水平,ELISA检测IL-1β、TNF-α的蛋白水平。结果:模型组α-SMA、CollagenⅠ、MMP2、MMP9、IL-1β、TNF-α、Notch2的水平高于对照组(P0.05),HFGF-21组α-SMA、CollagenⅠ、MMP2、MMP9、IL-1β、TNF-α、Notch2的水平均低于模型组(P0.05)。结论:FGF-21可抑制Notch2的表达,抑制炎症反应,从而抑制HSC的活化,发挥抗肝纤维化作用。