同步PCR技术及其在植物核酸分子定量中的应用

同步PCR是一种集生化、光电和计算机技术于一体的封闭式DNA扩增系统,采用荧光染料将扩增与检测过程结合在一起,实现了在PCR过程中在线显示PCR反应,通过检测荧光强度来绝对定量起始模板的拷贝数.该技术大大简化和加速了核酸分子的定量过程,不仅快速、灵敏、准确、重复性好,而且很容易计算出待测样品中核酸分子的绝对起始拷贝数.同微阵列等分子生物技术一起,同步PCR技术将会在功能基因解析和病害分子诊断等方面发挥重要作用.本综述除了介绍同步PCR技术的原理和应用外,还介绍了定量拟南芥Aux/IAA基因的转录水平的实验,并就同步PCR操作过程中的问题进行了讨论.     

落叶松人工林单木模型的研究

根据吉林省松江河林业局所实测的落叶松人工林(Larix olgensis)临时标准地66块、固定标准地18块以及8块团状枝解析样地资料,通过对林分中优势木生长及树冠结构与动态的分析,提出适于树木生长的Korf方程并用来构造林木的潜在生长函数。选择林分密度指数(SDI)作为反映林分中林木之间平均拥挤指标。在单木竞争指标的选择上,通过引进树冠因子,并在与传统的竞争指标相比较的基础上,淡化距离因子的作用,应用优势木相对树冠表面积构造了与距离无关的单木竞争指标,以此建立了落叶松人工林单木生长模型。     

胃癌及癌旁组织定量比较蛋白质组学研究

为寻找胃癌特异的肿瘤标记物,用于胃癌临床诊断及药物治疗靶点的选择,本研究采用荧光差异显示凝胶电泳（DIGE）技术分离并筛选 Cy3、Cy5 及 Cy2 荧光素标记的胃癌及对应癌旁组织差异表达蛋白质,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）或串联质谱技术进行鉴定并分析。结果共筛选出 33 个差异表达蛋白质点,其中 9 个蛋白质点在胃癌组织中上调,24 个蛋白质点下调。对 22 个蛋白质点采用质谱技术成功鉴定,突变结蛋白、锰超氧化物歧化酶、热休克蛋白 60等在胃癌中高表达,热休克蛋白 27、前列腺素 F 合酶、硒结合蛋白 1、锌指蛋白 160、微管蛋白 α6、真核生物翻译延伸因子 1 α1 等在胃癌组织中低表达,并筛选出 5 个未知蛋白。这些差异表达蛋白可望成为胃癌诊断的特异标记物,并与胃癌的发生、发展及预后等有关,为胃癌的诊断、发生机制的研究提供了新的思路。     

稻麦叶片氮积累量与冠层反射光谱的定量关系

作物氮素积累动态是评价作物群体长势及估测产量和品质的重要指标,对于作物氮素的实时监测和精确管理具有重要意义。该文以5个小麦(Triticum aestivum)品种和3个水稻(Oryza sativa)品种在不同施氮水平下的3年田间试验为基础,综合研究了稻麦叶片氮积累量与冠层反射光谱的定量关系。结果表明,不同试验中拔节后叶片氮积累量均随施氮水平呈上升趋势;稻麦冠层光谱反射率在不同施氮水平下存在明显差异,可见光区(460~710 nm)反射率一般随施氮水平的增加逐渐降低,近红外波段(760~1 220 nm)反射率却随施氮水平的增加逐渐升高;就单波段而言,810和870 nm处的冠层光谱反射率均与稻麦叶片氮积累量具有相对较高的相关性;在光谱参数中,比值植被指数(Ratio vegetation index, RVI)(870,660)和RVI(810,660)均与稻麦叶片氮积累量具有高度的相关性,且相关系数明显高于单波段反射率,尤其是水稻作物;对于小麦和水稻,均可以利用统一的波段和光谱指数来监测其叶片氮积累量,并可以采用统一的回归方程来描述其叶片氮积累量随单波段反射率和反射光谱参数的变化模式,但若采用单独的回归系数则可以提高稻麦叶片氮积累量估测的准确性。     

应用改良的实时TaqMan荧光定量 RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平

将改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术应用于口蹄疫病毒感染体内和体外的定量检测以及其3D基因转录水平分析.结果表明对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达l0个基因拷贝,可同时检测病毒正负链复制水平且重复性较好,所测口蹄疫病毒3D基因转录水平可高达6.9×104拷贝/μL;与实时SYBR GreenⅠ染料RT-PCR技术比较,改良的实时TagMan荧光定量RT-PCR技术检测灵敏度高6.7倍.以上结果证实,改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术在病毒检测和基因表达水平分析方面有更高的灵敏度和特异性.     

荧光定量PCR技术检测样品中SeMNPV有效含量

采用NCBI提供的BLAST软件在线检索SeMNPV特异性基因ORF22、ORF40,并将其构建到pMD18-T载体上.以纯化的pMD18-T-ORF22、pMD18-T-ORF40质粒为标准样品,已计数野生型SeMNPV的基因组作对照,用荧光定量PCR检测样品中SeMNPV多角体含量.荧光定量PCR检测得到标准曲线方程为con=10(-0.282CT+9.965) (相关系数R2=0.9997)和con=10(-0.296CT+9.945) (相关系数R2＝0.9995).测得一个SeMNPV多角体包含102核酸分子,检测到SeMNPV复合剂包含 633 PIBs/mg、691 PIBs/mg SeMNPV多角体,两者结果一致.与复合剂中SeMNPV实际含量相符.     

耐低磷水稻基因型筛选指标的研究

采用溶液培养试验,并结合大田试验,研究和探讨了耐低磷水稻基因型的筛选指标.结果表明,溶液培养试验中,在正常供磷和低磷胁迫条件下,在所有调查性状中水稻单株干重都具有较大的基因型间变异(CV分别为21.73%和19.54%).在所有调查性状的相对值中,相对单株干重(低磷胁迫/正常供磷)也具有较大的基因型间变异(CV为19.60%);相关分析表明,相对单株干重与相对根干重、相对株高、相对单株吸磷量、相对地上部磷积累、相对磷利用效率和相对植株磷浓度均呈极显著正相关(P＜0.01).因此,水稻相对单株干重可以作为苗期筛选水稻耐低磷基因型的一个筛选指标.溶液培养试验中水稻的相对单株干重和大田试验中水稻的相对稻谷产量(不施磷/施磷)没有显著相关性,因此溶液培养试验的相对单株干重不能作为评价大田试验中水稻耐低磷能力的指标.低磷营养液培养的水稻体内磷利用效率与缺磷土壤生长的水稻体内磷利用效率呈极显著正相关.因此,直接以低磷营养液培养水稻苗期体内磷利用效率作为筛选指标,然后进行大田试验验证,是一条筛选水稻磷高效利用基因型的有效途径.     

实时荧光定量PCR检测感病蝗虫体内绿僵菌rDNA基因

根据绿僵菌23SrDNA的转录间隔区(ITS)和5.8S的基因序列,设计检测感病蝗虫体内绿僵菌菌体DNA分子的特异引物,通过优化感病蝗虫菌体DNA快速制备方法,建立了基于荧光定量PCR的定量检测体系。该检测方法专一、灵敏,检测下限为10pg/μl绿僵菌,并且能从刚侵染48h的东亚飞蝗血淋巴中,早期定量检测到在虫体血淋巴中增殖的绿僵菌的rDNA。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

HzAm1细胞rpL13基因的序列分析及病毒感染对其转录水平的影响

从美洲棉铃虫细胞(HzAM1)中克隆了核糖体大亚基蛋白L13(Ribosomal protein L13,RpL13)的cDNA及其基因组DNA序列,并进行了序列分析.其编码框为666bp,无内含子,预测编码大小约为25 kDa的蛋白.通过与其它15种动物的RpL13编码框序列进行进化分析,发现聚类结果与传统物种分类一致.转录研究表明,棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)感染HzAm1后使rpL13在细胞内的转录水平降低,在病毒感染后96h,rpL13 mRNA的拷贝数降到对照健康细胞的8%.