离体培养细胞系冷休克敏感差异性的研究

应用台盼蓝活体染色方法、Hoechst332 5 8荧光探针技术研究低温冷休克 (4℃ )对人肝癌细胞系 (74 0 2 )、秋行军虫细胞系 (Sf9)、幼蚊细胞系 (C6 36 )及草鱼肾细胞系 (CIK)的影响。结果显示 :在冷休克处理 6天后 ,Sf9、C6 36、CIK、74 0 2细胞系的死亡率分别是 2 0 .0 3%、10 0 %、2 8.6 9%、10 0 % ;凋亡率分别为 2 .4 5 %、38.38%、8.2 5 %、96 .4 7% ,其细胞的死亡率远远大于凋亡率。可见冷休克导致细胞死亡过程中 ,应是细胞坏死和凋亡并存。但就其细胞凋亡的敏感性而言 ,4种细胞顺序应为 74 0 2 >C6 36 >CIK >Sf9。研究结果为在细胞水平、分子水平深入研究低体温生物离体细胞冷休克机理奠定基础。     

黑色素抑制流感病毒诱导宿主细胞凋亡

The apoptosis induced by influenza virus in cultured MDCK cells was reported and the selective inhibitory effect of melamin on the apoptosis induced by influenza virus was investigated. The results showed that the DNA ladder could be first detected at 6 h post-infection (p.i.), accompanied by nuclear condensation and nuclear fragmentation could be easily detected at 12 h p.i. In addition, the apoptosis-induced activity of influenza virus A1/Jingfang 86-1 strain was more potent than that of B/Hufang 93-1 strain (P＜0.05). In the range of 20-125 μg/mL, melanin was found to significantly (P＜0.001) inhibit apoptosis induced by 64 hemagglutination unit influenza virus infection with a inhibitory rate comparable to that obtained by virazole and showed no cytotoxicity. The inital results suggested that the mechanism of melanin against the apoptosis induced by influenza virus was related to the blockage of viruses' adsorbtion to the host cells.     

极端嗜盐菌冷冻干燥保藏研究

本文报道了不同浓度的海藻糖和蔗糖作为保护剂对盐生盐杆菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｂｉｕｍ）Ｒ＿１菌株冷冻干燥存活性的影响。结果表明：６％海藻糖,１２％蔗糖和１５％ＮａＣｌ组成的混合保护剂,是冷冻干燥保藏Ｒ＿１菌株极佳的保护剂。采用该保护刑冷冻干燥２５株极端嗜盐菌,于４℃保藏１４个月,经液体培养基和斜面培养基培养检测,全部存活。     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的稳定性研究

以本实验室建立的CSFV39-PKl5持续感染细胞模型为实验材料，综合运用免疫荧光、RT-PCR、流式细胞仪，对其稳定性进行研究。实验结果均表明，该细胞模型有着良好的稳定性。即使在连续传至128代的CSFV39-PKl5传代细胞中，CSFV仍持续存在：呈免疫荧光抗体反应阳性和RT-PCR检测阳性。同时，该细胞与正常的PK-15细胞相比，细胞周期无显著差异。通过同段序列的同源性比较，发现CSFV39与CSFV石门株的同源性最高，达99．02％。     

miRNA干扰口蹄疫病毒基因组早期复制的初步研究

根据miRNA的设计要求,以miR-31为模型通过软件设计出潜在的能够使3D基因沉默的特异性miRNA序列3D-1203,并以pcDNA3.1(+)质粒为载体构建能够表达成熟miRNA的重组质粒,将其转染到BHK-21细胞后感染口蹄疫病毒,研究3D-1203的miRNA的干扰作用。蚀斑实验结果显示特异性miRNA可以在早期抑制口蹄疫病毒的复制,与阳性对照相比,病毒复制效率降低53.0%。实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测数据表明特异性miRNA干扰病毒基因组增殖的效率达66.7%。本研究证明,利用miR-31设计的特异性miRNA在病毒复制早期能够特异的干扰口蹄疫的复制。     

应用改良的实时TaqMan荧光定量 RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平

将改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术应用于口蹄疫病毒感染体内和体外的定量检测以及其3D基因转录水平分析.结果表明对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达l0个基因拷贝,可同时检测病毒正负链复制水平且重复性较好,所测口蹄疫病毒3D基因转录水平可高达6.9×104拷贝/μL;与实时SYBR GreenⅠ染料RT-PCR技术比较,改良的实时TagMan荧光定量RT-PCR技术检测灵敏度高6.7倍.以上结果证实,改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术在病毒检测和基因表达水平分析方面有更高的灵敏度和特异性.     

口蹄疫病毒持续感染细胞系的快速选择及其特性研究

采用NH4Cl弱碱法处理感染口蹄疫病毒的叙利亚仓鼠肾细胞系(BHK—21),存活细胞经过单克隆和选择,获得32株阳性克隆细胞株。随机选取一株(BHK—ROp),常规传代并采用RT-PCR,透射电子显微镜,流式细胞仪进行持续感染特性分析,结果表明,BHK—ROp第4,16,36代细胞中病毒持续存在,但不影响细胞的生长特性,表现出病毒持续感染的基本特征。可见,NH4Cl弱碱法用于建立病毒持续感染细胞系是十分有效的。     

冷休克诱导肿瘤细胞凋亡的动力学特征

应用扫描电镜观察、末端DNA转移酶介导的脱氧UTP缺口末端标记技术（TUNEL）和流式细胞术研究低温冷休克诱导人乳癌细胞系（ZR－75－30）细胞凋亡,并对其细胞凋亡的动力学特征测定、分析。结果显示：－5℃、0℃、4℃冷休克均可诱导ZR－75－30细胞凋亡,但细胞凋亡进程受实验细胞预培养时间;冷休克温度、时间;细胞冷休克后恢复培养时间的影响,这些影响因素具有明显的动力学特征。经过对冷休克诱导ZR－75－30细胞凋亡的动力学特征分析、比较,优选出研究冷休克诱导肿瘤细胞凋亡的实验体系：即细胞经37℃细胞凋亡的动力学特征分析、比较, 优选出冷休克诱导肿瘤细胞凋亡的实验体系：即细胞经37℃预培养36h→冷休克（-5℃24h,0℃36h,4℃48h）→细胞冷休克后于37℃恢复培养18－24h→细胞凋亡检测→检测结果综合分析。应用该实验体系要使细胞凋亡率达50－60％,且重复性尚佳。优化体系的深入研究冷休克诱导细胞凋亡的信号传递及其分子机制提供实验模型。     

鱼呼肠孤病毒诱导草鱼肾细胞凋亡

采用荧光显微镜、电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪分析等技术研究鱼呼肠孤病毒诱导草鱼细胞（ＣＩＫ）调亡。结果显示,鱼呼肠孤病毒感染ＣＩＫ细胞后,光镜下可见空斑形成;荧光染色观察到细胞调亡碎裂核;且电镜下呈现细胞核裂解,核周裂隙增大,细胞膜内陷并出泡形成调亡小体现象;琼脂糖凝胶电泳出现１８０－２００ｂｐ整数倍的ＤＮＡ梯形带;流式细胞仪检测到典型的细胞调亡峰,在病毒感染４８ｈ,细胞调亡百分率达１５     

细菌转化黑色素的抗流感病毒作用

采用敏感的ＭＴＴ法测定了嗜麦芽假单胞菌转化黑色素的抗流感病毒作用。测定结果表明：纯化的黑色素毒性极低,对ＭＤＣＫ细胞的无毒界限为０．２ｍｇ／ｍｌ,远高于其有效的作用浓度;１０～２０μｇ／ｍｌ的黑色素能有效抑制流感病毒（血凝效价１∶３２）致细胞病变。病毒感染７２ｈ后用ＭＴＴ法测定,其宿主ＭＤＣＫ细胞保护百分率达９５％以上;此外,加黑色素后的ＭＤＣＫ细胞,抗流感病毒感染的能力优于目前抗病毒的有效药物病毒唑,前者的最佳作用浓度（２０μｇ／ｍｌ）比后者（１００μｇ／ｍｌ）低５倍。可以认为嗜麦芽假单胞菌转化黑色素具有毒性低、抗流感病毒能力强的特点