CRISPR-Cas核酸酶及其人工改造变体和单碱基编辑器在植物中的应用

规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)和单碱基编辑器是植物基因编辑的基本工具。来自酿脓链球菌的Cas9(SpCas9)可以识别NGG前间区序列邻近基序(PAM),是一种广泛应用于活细胞基因组编辑的核酸酶。Cas12a核酸酶最近也在多种植物中实现了靶向识别富含T的PAM序列。     

岩藻糖基化人乳低聚糖在新生儿无乳链球菌肺炎治疗中的作用

目的探讨岩藻糖基化人乳低聚糖在新生儿无乳链球菌肺炎中的治疗作用。方法收集本院2015年7月至2017年2月痰培养阳性新生儿无乳链球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染性肺炎病例,分析不同喂养方式、不同病原类别肺炎在住院时间、炎症、并发症等指标差异,探讨岩藻糖基化人乳低聚糖对无乳链球菌感染的独特治疗作用;使用含有不同浓度岩藻糖基化人乳低聚糖的培养基对无乳链球菌进行培养,研究岩藻糖基化人乳低聚糖抑制无乳链球菌的最佳浓度;分别使用岩藻糖基化人乳低聚糖或酸性人乳低聚糖加入培养基中对无乳链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌进行培养,进一步探讨岩藻糖基化人乳低聚糖对无乳链球菌的独特抑制作用。结果无乳链球菌肺炎患儿,母乳喂养组的住院时间较人工喂养组住院时间减少[(8.35±0.77)d vs(10.91±0.54)d,t=1.557 676,P<0.05)],PCT值较人工喂养组低[(2.38±0.63)ng/mL vs(8.69±2.23)ng/mL,t=1.419 964,P<0.05],白细胞计数较人工喂养组低[(13.28±1.08)×10^9/L vs(16.16±0.98)×10^9/L,t=1.878 447,P<0.05],脑膜炎发生率较人工喂养组低(5%vs 35%,χ^2=5.601 353,P<0.05),呼吸机使用率较人工喂养组低(10.0%vs 36.4%,χ^2=4.005 042,P<0.05);大肠埃希菌肺炎患儿、肺炎克雷伯菌肺炎患儿,母乳喂养组与人工喂养组比较,住院时间稍减少,PCT值、白细胞计数、脑膜炎发生率和呼吸机使用率均有所降低,差异无统计学意义;细菌培养实验发现岩藻糖基化人乳低聚糖在2.5 mg/L浓度的时候可以明显抑制无乳链球菌的生长,对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌无明显抑制作用,酸性人乳低聚糖对3种细菌均无抑制作用。结论岩藻糖基化人乳低聚糖可以明显抑制无乳链球菌的生长,可能成为未来无乳链球菌感染性肺炎治疗中新的靶点,值得深入研究。     

妊娠晚期阴道B族链球菌的感染对肠道菌群和妊娠结局的影响

目的探究妊娠晚期阴道B族链球菌(group B Streptococcus,GBS)的感染对肠道菌群和妊娠结局的影响。方法选取2018年3月至2019年11月大连市中心医院孕检并分娩的妊娠妇女744人为对象,调查并统计B族链球菌的感染率;筛选有和没有B族链球菌感染妊娠妇女各47人,调查不良妊娠结局的发生率;选取信息匹配的妊娠晚期阴道B族链球菌感染和未感染的妊娠妇女,采集粪便样本,提取菌群DNA,用16S rDNA方法分析菌群变化。结果744名妊娠妇女中B族链球菌检出49例,感染率为6.59%;B族链球菌感染组总的不良妊娠发生比例为76.6%,正常组发生比例为27.7%(χ^2=5.491,P<0.05)。B族链球菌感染组妊娠妇女胎膜早破(χ^2=16.177,P<0.01)、难产(χ^2=21.134,P<0.01)和羊水异常(χ^2=22.989,P<0.05)的发生率与未感染组比较显著增高。B族链球菌感染组妊娠妇女肠道菌群发生显著变化。结论妊娠晚期阴道B族链球菌的感染可能引起肠道菌群紊乱,增加不良妊娠结局。     

益生菌防治龋病的研究进展

随着人们生活水平日益提高,口腔健康越来越受到关注。近年来,益生菌对口腔菌群和宿主健康的调节作用已成为广泛研究的话题。已有证据表明,益生菌可以竞争性地抑制口腔中致病细菌的黏附和定植,分泌抗菌物质以减少病原菌。本文综述了相关益生菌对变形链球菌这一公认的龋齿病原菌的作用,包括:(1)生物表面活性剂、细菌素、胞外多糖等益生菌代谢产物对变形链球菌牙菌生物膜的抑制作用;(2)刺激宿主免疫反应,调节口腔菌群组成;(3)下调或阻断变形链球菌细胞中与黏附在牙齿表面形成生物膜相关的基因表达。     

不同功能基团对3型肺炎球菌荚膜多糖免疫原性影响的初步研究

目的比较3型肺炎链球菌荚膜多糖不同基团活化对多糖抗原性及结合物免疫原性的影响。方法分别采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate, CDAP)活化多糖羟基,碳二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)活化多糖羧基,再与己二酰肼(adipic dihydrazide, ADH)偶联获得活化度相近的多糖衍生物。用三硝基苯磺酸方法(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)测定多糖活化度;高效液相分子排阻与多角度激光散射仪联用(HPLC-SEC-MALLS)分析衍生物分子分布和大小;Zeta电位仪与滴定仪联用分析其表面电荷变化;速率比浊法和免疫双扩散法比较其抗原性变化;利用多糖衍生物与载体蛋白偶联获得的不同结合物免疫小鼠,间接ELISA分析不同结合物免疫后的IgG抗体浓度,进一步阐述活化过程中多糖抗原性的变化对结合物免疫原性的影响。结果 TNBS结果显示,获得同一基团不同活化度(5%～30%)、不同基团(羟基和羧基)活化度相近的多糖衍生物;等电点分析结果显示,不同基团的活化会导致多糖表面不同的电荷变化;而速率比浊和免疫双扩散的结果显示,多糖羟基的活化会导致多糖抗原性略有下降,但不同活化度之间差异较小;在相似活化度情况下,羧基衍化物的抗原性更低,随着羧基活化度的增加,多糖抗原性下降明显(约60%)。小鼠ELISA结果显示,对羧基不同程度活化得到的结合物,其免疫原性较多糖明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05);随着多糖羧基活化度的增加,结合物免疫原性先增加后降低。结论 3型多糖重复单位上的羧基的改变对抗原性影响较羟基更大,对羧基的过度活化会影响结合物的免疫原性。     

V型羊毛硫肽雷可肽的抑菌机制

【背景】雷可肽(Lexapeptide)为首例V型羊毛硫肽家族化合物,具有较好的抗革兰氏阳性菌活性,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和表皮葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis,MRSE)的抑制作用强于广泛应用的食品防腐剂乳酸链球菌素,其对pH和高温的稳定性也优于乳酸链球菌素,具有较好的应用前景。由于抑菌机制不明确,限制了雷可肽的开发应用。【目的】探究雷可肽抑菌作用特征以及作用机制,为雷可肽开发应用奠定基础。【方法】通过菌落计数法与Mg2+试验表征雷可肽抑菌动力学曲线;采用流式细胞仪和透射电子显微镜研究雷可肽在靶细胞表面的成孔性;利用高效液相色谱与基质辅助激光解吸电离的时间飞行质谱分析雷可肽处理对革兰氏阳性菌肽聚糖前体积累的影响。【结果】雷可肽在抑菌动力学上与乳酸链球菌素没有显著差别,但在更宽的Mg2+浓度范围内仍可保持抑菌活性。雷可肽处理后的细胞具有透过荧光染料的能力,生物型透射电镜观察到细胞发生破损。此外,在雷可肽作用后的细胞中检测到肽聚糖合成的前体尿嘧啶核苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸五肽。【结论】雷可肽能够通过抑制细胞壁肽聚糖生物合成并造成细胞损伤进而获得通透性,以此来抑制革兰氏阳性菌生长。     

链球菌病类活疫苗活菌计数参考品的研制

研制链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,可以更加科学地评价活菌计数结果的准确性和有效性。首先,制备了一批链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,对其物理性状、纯粹性、真空度、剩余水分进行检验,并对其均一性、运输稳定性、热稳定性进行测定,另组织3家单位通过协作标定的方式对参考品活菌数进行赋值,用协作标定法统计参考品在12个月内的保存期。参考品的性状检查、纯粹检验、真空度测定和剩余水分测定结果均符合《中国兽药典》的规定;均一性试验结果显示,参考品计数结果的变异系数小于10%,均一性良好;运输稳定性试验证明,参考品在夏季和冬季用泡沫盒加冰袋的方式运输3日内数值仍能保持稳定;加速热稳定性试验验证,参考品在–20 ℃条件下保存3个月、4 ℃条件下保存21 d内均可活菌数稳定;通过协作标定,统计出参考品活菌数的赋值范围为 (8.5–12.1)×107 CFU/支;保存期试验结果证实,参考品在–70 ℃以下保存一年内活菌数可维持稳定状态。链球菌病类活疫苗活菌计数参考品,不仅可以为链球菌病类活疫苗的活菌计数实验提供参照物,而且可以用于评价马丁琼脂培养基的质量,为兽用生物制品质量控制提供保障。     

儿童肺炎肺实变住院患儿支气管肺泡灌洗液病原分析

本研究分析肺炎肺实变患儿支气管肺泡灌洗液病原谱构成,旨在为临床经验性抗感染治疗提供指导。收集2019年1月-2020年1月复旦大学附属儿科医院纤维支气管镜室诊治的住院肺炎病例临床资料,其中肺实变的诊断基于影像学证据,依托国家儿童医学中心病原学检测平台,并参考感染传染科医生解读,本研究对肺炎伴肺实变患儿支气管肺泡灌洗液标本的病原学检测结果进行回顾性分析。结果显示,286例肺炎患儿的286份支气管肺泡灌洗液标本被纳入研究,平均年龄5.5(5.8±3.1)岁,其中195例(68.2%)存在肺炎伴肺实变。总病原体检出率为76.6%(219/286),肺实变和无肺实变肺炎患儿病原体检出率分别为77.9%(152/195)和73.6%(67/91),差异无统计学意义;检出的前5种病原体均为肺炎支原体、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型。5周岁及以上患儿肺炎支原体检出率达最高77.0%(127/165),肺实变病例和无肺实变病例肺炎支原体检出率分别为67.2%(131/195)和61.5%(56/91),差异无统计学意义。本研究结果提示,肺炎支原体、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型是导致本研究目标人群患病的主要病原体;病原体检出率高低与是否肺实变无关。     

灰色链霉菌胰蛋白酶在变铅青链霉菌中的异源表达及酶学性质分析

胰蛋白酶作为一种重要的丝氨酸蛋白酶被广泛应用于食品、医药和皮革等工业领域.本文成功实现了灰色链霉菌来源的胰蛋白编码基因在变铅青链霉菌中的高效活性表达,并对其酶学性质进行分析比较.以灰色链霉菌ATCC10137基因组为模板,获得胰蛋白酶编码基因sprT并克隆至表达质粒pIJ86,成功构建了重组链霉菌工程菌TK24/pIJ86-sprT.以R2YE和SELF为发酵培养基,最高酶活分别达9.21 U/mL和8.61 U/mL.酶学性质分析表明,和牛胰蛋白酶(BT)相比,重组链霉菌胰蛋白酶(rSGT)的耐酸能力强,具有较广的pH;且rSGT对酰胺键具有更高的特异性;此外,Zn2+和有机溶剂分别对rSGT的酯酶活力和酰胺酶活力具有促进作用;本研究结果为rSGT的性质改造以及工业应用提供了依据.