反义细胞周期蛋白E真核表达载体的构建及其对体外人乳腺癌细胞的抑制作用

 为了探讨细胞周期蛋白 E(cyclin E)与人乳腺癌细胞恶性特征间的相关性 ,利用反义 RNA抑制基因表达的技术 ,构建了细胞周期蛋白 E反义 RNA的真核表达载体并转入人乳腺癌细胞中 .通过 G41 8筛选出阳性克隆 ,经 PCR和 Western印迹检测 ,确定细胞中含有重组质粒 ,并且细胞周期蛋白 E蛋白的水平明显降低 ,由此获得了反义 RNA表达载体导致的细胞周期蛋白 E表达受抑制的细胞 .细胞模型建立后 ,观察分析了细胞形态 ,细胞生长的血清依赖性以及软琼脂成集落能力 ,与对照细胞相比所发生的变化 .结果显示 ,细胞周期蛋白 E受抑制后 ,乳腺癌细胞体积变大 ,细胞生长对血清依赖性增加 ,低血清培养到第 6d时 ,细胞密度约为对照细胞的五分之一 ,细胞成集落能力也显著下降 ,软琼脂中克隆形成率下降 57% .这些变化都表明乳腺癌细胞恶性程度由于细胞周期蛋白 E表达受抑制而减弱 ,可以推测 cyclin E与乳腺癌细胞的恶性增殖及非锚定依赖性生长有着明显的关系 .     

端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞损伤修复能力的影响

 利用反义核酸技术将端粒酶RNA的全长cDNA反向导入乳腺癌MCF 7细胞基因组中 .通过单细胞凝胶电泳实验发现 ,其DNA受H2 O2 损伤后的修复能力下降 .但端粒酶活性抑制为何引起其DNA损伤修复能力下降的原因尚待进一步研究 .     

基因功能的研究方法

人类基因组计划的顺利进行使基因功能研究成为生命科学领域中的重大课题,基因转导、反义技术、转基因和基因剔除、染色体转导、RNA干涉等是目前研究基因功能的主要方法,新的技术不断涌现,且各有其特点和局限性。     

端粒酶RNA组分的反义寡核苷酸对BEL—7404人肝癌细胞端粒酶活性的抑制和细胞凋亡的诱导

Telomerase activity was detected in all of four human hepatoma cells but absent in normal liver tissue. Telomerase activity of BEL-7404 human hepatoma cells was inhibited effectively by antisense oligonucleotide to telomerase RNA component at final concentration of 1 mumol/L, whereas sense and missense oligonucleotides have no effects on its activity. The inhibition of telomerase activity was weakened, as the concentration of antisense oligonucleotide decreased. Treating BEL-7404 human hepatoma cells 96 hours continuously by the antisense oligomers at final concentration of 5 mumol/L, the morphology of treated cells changed and apoptosis percent of the cells increased markedly.     

RAB5A基因表达改变对人肺腺癌细胞系GLC-82和SPC-a1的分化和侵袭特性影响

为探讨RAB5A基因对两种人肺腺癌细胞系GLC－82和SPC－al分化及侵袭特性的影响。利用细胞转染技术将构建的RAB5A反义RNA重组质粒（pcDNA3-AntiRAB5A)和RAB5A正义真核表达载体分别转染入低分化人肺腺癌细胞系GLC－82和低转移人肺腺癌细胞系SPC－al中,在稳定筛选后,通过裸鼠体内实验和体外人工基底膜侵袭和细胞趋化运动实验,观察观察转染后细胞分化和转移特性的改变,观察转染前后细胞,发现转染后GLC－82细胞体外侵袭重组基底膜能力及趋化运动能力降低（t检验P＜0．02）;裸鼠体内成瘤实验,瘤块切片病理观察转染后GLC－82细胞出现腺腔样及基底模样结构,分化程度增高,转染后SPC－al细胞体外趋化运动能力,侵袭重组基底膜能力均增强(t检验P＜0．02）。RAB5A基因通过影响细胞的体外趋化运动能力,侵袭重组基底膜能力等对GLC－82和SPC－al细胞的侵袭表型形成及GLC－82细胞的分性发挥重要作用。     

阳性脂质体介导反义寡聚核苷酸转染HeLa细胞的效果研究

采用FITC标记的未经修饰的和经过修饰的两种19-mer反义寡聚核苷酸序列(ODN19和S-ODN19)作为转染物质,用流式细胞技术(FCM)研究比较几种常用阳性脂质体介导的寡聚核苷酸转染HeLa细胞的效果及适宜的转染时间。未经化学修饰的ODN19转染结果显示,LipofectAmine和DM-RIE-C增强转染的作用相对较强,而其他两种脂质体的作用并不明显。对于经过修饰的S-ODN19转染而言,四种阳性脂质体均具有增强S-ODN19转染作用,但以LipofectAmine的效果最为明显,其转染效果(FITC均值为5203.11)为无脂质体介导对照的数十倍。四种阳性脂质体的增强转染作用排序为:LipofectAmine>FuGENE6>Lipofectin>DM-RIR-C。另外,在用FuGENE6介导寡聚核苷酸转染时,采用4小时转染时间可获较好转染效果。     

通过诱导剂作用于启动子的条件性基因表达

通过遗传工程技术获得的转基因动植物对分析某些生化过程和发育途径极为有用。通过化学诱导剂作用于启动子的条件性基因表达是分子生物学和生物技术应用研究中的强有力的手段。建立于目标基因激活和失活基础之上的几个究子诱导基因表达系统已有报道。将来自于原核生物、昆虫和其它动物的调节因子应用于新的物种有利于促进转基因技术的应用和有关基因的时空表达研究。本文综述了有关的基因表达调节系统,启动子激活的基因表达系统,启动子失活的基因表达系统,以及可诱导的基因过度表达和反义抑制系数。     

四个与小鼠摄食、摄水量及蛋白质代谢相关基因的功能研究

目的　通过对小鼠摄食、摄水量及蛋白质代谢相关基因的功能研究 ,为今后的营养学和营养疾病学的分子生物学水平研究提供一定的依据。方法　利用反义核酸技术与动物行为学实验方法相结合 ,从动物整体水平上研究与动物膳食和营养代谢相关的基因功能。从课题组以往研究得到的摄食量与对照组有显著差异的基因中选出 4个 ,用BALB c小鼠进行实验。结果　实验结果表明 :D1、Pe和Tr实验组小鼠的摄食量、摄水量与对照组有明显的差异 ,D1和Tr实验组的蛋白质代谢与对照组有明显的差异。D1实验组小鼠的摄食量和摄水量明显高于对照组并呈下降趋势 ,但其表观消化率小于对照组 ,说明其蛋白质代谢功能有所下降 ;Tr实验组小鼠的摄食量和摄水量也明显高于对照组但呈上升趋势 ,其表观消化率大于对照组 ,说明其蛋白质代谢功能有所上升。结论　预测D1基因可能与促进营养代谢功能有关 ,Tr基因可能与抑制营养代谢功能有关。D1、Pe和Tr与移动、痛觉、记忆等其他行为学有相关性 ,P3与其他行为学无相关性。     

RNA干扰作用(RNAi)研究进展

RNA干扰作用 (RNAi)是生物界一种古老而且进化上高度保守的现象 ,是基因转录后沉默作用 (PTGS)的重要机制之一 .RNAi主要通过dsRNA被核酸酶切割成 2 1～ 2 5nt的干扰性小RNA即siRNA ,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现 .RNAi要有多种蛋白因子以及ATP参与 ,而且具有生物催化反应特征 .RNAi是新发现的一种通过dsRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径 ,在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中具有广阔应用前景     

红细胞分化相关因子EDRF1的反义RNA下调蛋白激酶C—αmRNA的表达

为了研究通过功能筛选得到的一个新的红细胞分化相关的全长cDNA（命名为EDRF1）的功能,选择K562细胞作为模型细胞来观察反义EDRF1表达对细胞功能的影响。通过快速构建,同时得到了正向和反向插入片段的真核表达载体pcDNA3－EDRF1－S（sense）及pcDNA3－AS（antisense）,并通过改进的LipofectAMINE细胞转染和G418筛选,得到了稳定性表达的细胞株,进行基因组PCR鉴定,证明了转染的高效性。Northem Blot试验的结果表明,反义载体转染的K562细胞中,EDRF1在mRNA表达水平上受到下调,提示EDRF1反义DNA的表达可能抑制了EDRF1mRAN的正常转录。进一步,γ－珠蛋白和PKC－α的表达在反义构建质粒转染K562细胞中的表达均受到下调,这可能传递了红细胞分化的负反馈信号,从而抑制了珠蛋白的合成。