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用改良消减杂交筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中高表达基因 总被引:2,自引:0,他引:2
为了研究类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis,RA)滑膜细胞 (fibroblast- like synovialcells,FLS)过度增殖和破坏软骨的分子机理 ,利用改良消减杂交法以骨性关节炎 (osteoarthritis,OA)病人滑膜细胞为对照 ,筛选 RA滑膜细胞中的高表达基因 .将得到的基因片段克隆入质粒载体 ,通过反向点杂交排除假阳性克隆后 ,将阳性克隆进行核酸序列分析 ,最后用 Northern杂交方法检测一些高表达基因在 RA和 OA病人滑膜细胞中的表达水平 .结果显示 ,共分离到 1 50个 RA高表达基因片段 ,其中长于 1 0 0 0 bp的片段占 8% (1 2 /1 50 ) ,长于 40 0 bp的片段占 36.7% (55/1 50 ) ,在大于 40 0 bp的片段中 ,假阳性率为 2 3.7% (1 3/55) .在测序的 1 8个片段中 ,已知基因有 1 2个 ,其中包括 IGF- 1结合蛋白 (IGFBP)特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B等 .新序列有 6个 ,其中两个序列分别与 Ring- box蛋白 1和 SON DNA结合蛋白同源 .对 IGFBP特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B基因的 Northern杂交分析显示 ,在 RA病人滑膜细胞中 ,这些基因的表达水平高于 OA病人滑膜细胞 .这些结果提示 ,这种改良消减杂交法是一种简便有效的分离差异表达基因的方法 ;IGF- 1结合蛋白特异性丝氨酸蛋白酶、层粘 相似文献
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带有蛋白转导结构域的Bcr/Abl癌蛋白片段的表达及其跨膜转运 总被引:3,自引:0,他引:3
HIV 1编码的反式激活蛋白TAT具有将细胞外蛋白转导进入细胞的基序 ,称为蛋白转导结构域 (PTD) .为研究PTD介导的PTD Bcr Abl融合蛋白的跨膜转运 ,合成了编码PTD的基因片段 ,并与PCR扩增的慢性粒细胞白血病癌蛋白bcr abl基因片段融合 .在大肠杆菌中表达纯化了融合蛋白 ,将纯化的融合蛋白加入培养的HL60细胞和C2C12细胞后 ,发现PTD基序可以介导Bcr Abl蛋白自由从细胞外跨膜转导进入细胞内 .研究结果可能为用外源蛋白负载 (loading)免疫活性细胞如抗原提呈细胞提供新的途径 . 相似文献
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目的:克隆并鉴定和分析人Cuedc2启动子,为进一步研究其转录调控机制和功能提供实验基础。方法:对Cuedc2基因翻译起始位点上游约2000bp的序列进行在线生物信息学分析,使用PCR技术扩增该序列并测序,将扩增获得的该片段定向克隆入PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒Cuedc2-luc。荧光素酶分析检测启动子的活性。结果:本实验成功构建了含有Cuedc2基因启动子序列的荧光报告系统,经体外验证该报告基因重组载体具有转录活性。结论:本实验所构建的Cuedc2基因启动子报告基因载体,为进一步研究Cuedc2基因的转录调控及其功能奠定了基础。 相似文献
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目的:为了获得NDRG3(N-Myc downstream regulated gene3)的cDNA,以成人脑组织为模板。方法:由特异性的引物通过RT—PCR方法扩增人NDRG3的编码基因,大小约为1.1 kb。将此基因插入PMD 18-T载体中,并进行酶切鉴定和序列测定。然后,将测序正确的片段亚克隆人原核表达载体pPROEX-HTb表达载体中,转化DH5α感受态细胞,并在LB培养基中获得高效表达。结果:这表明成功地进行了人NDRG3的克隆和表达,为进一步研究NDRG3的功能奠定了良好的基础。 相似文献
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p53对restin基因转录表达的调控作用 总被引:1,自引:1,他引:0
restin基因是Zhu等人从全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导肿瘤细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤抗原相关基因. 前期研究表明, 该基因与细胞周期阻滞有关. 由于p53在细胞增殖调控中占据重要地位, 并且与维甲酸具有诱导关系, 因此本研究试图揭示维甲酸诱导restin基因表达是否与p53有关. 将p53转染真核细胞, 研究restin与p53的表达关系. 结果表明p53能诱导restin基因转录增加. 进一步分析发现, restin基因5¢端上游约2 kb基因组序列中存在p53蛋白结合位点. 扩增该序列构建荧光报告系统, 检测到该报告系统可以接受维甲酸的诱导调控. 在此基础上, 研究p53对缺失p53结合位点的截短体报告质粒和p53结合位点突变后的报告质粒的作用, 结果显示p53调控restin基因的表达与该基因上游序列区中的p53结合位点无关, 推测p53对restin基因的表达调控可能还存在其他分子的相互作用. 相似文献
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目的:为实现慢病毒感染后可用抗生素筛选外源基因稳定整合的细胞,我们对慢病毒载体质粒(pWPT-GFP)进行了改构。方法:将三种抗生素抗性基因(puro、hygro、neo)连同其启动子分别克隆入慢病毒载体(pWPT-GFP)。酶切鉴定载体构建正确后,将这三种改构载体分别与辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T包装细胞,收获病毒上清并感染靶细胞,使用相应抗生素筛选细胞验证抗性基因的插入。结果:成功构建了重组慢病毒载体pWPT-GFP-puro、pWPT-GFP-hygro、pWPT-GFP-neo,通过调整病毒上清的用量可以达到靶细胞100%的感染效率;用相应抗生素筛选细胞证明了抗性基因的表达。结论:我们成功改构了慢病毒载体(pWPT-GFP),从而使病毒感染后用抗生素筛选稳定整合的细胞成为可能。 相似文献
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目的:为探讨SPARC(secreted protein acidic and rich in cysteine)在人恶性肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制,进一步明确SPARC发挥作用的方式及其与肿瘤发生类型的关系。方法:我们首先提取了人乳腺癌细胞系MCF-7的总RNA,在对总RNA进行纯度与定量检测后,利用RT-PCR的方法,以该总RNA为模板,将其反转录为cDNA;再设计引物,以该cDNA为模板,利用PCR扩增出包含Sparc编码区的DNA片段,将该产物纯化后通过T-A克隆连接入pMD20-T载体,利用菌落PCR及DNA测序进行鉴定。以pMD20-T-Sparc为模板,我们设计了特异的针对Sparc全长编码区的引物,并在引物5'端分别加入BamHI、HindIII酶切位点,通过PCR将Sparc编码区扩增出来,经纯化及双酶切后与真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)相连,再经菌落PCR和DNA测序进行鉴定。通过瞬时转染的方法,利用脂质体将所构建的重组SPARC真核表达载体转染HEK293细胞,48h后裂解所培养的细胞,使用western blot检测有无SPARC的表达。结果:测序证实所克隆的Sparc编码区cDNA正确地插入pcDNA3.1myc-his(-)中,western blot检测证实其在HEK293细胞中得到表达,而空载体转染的细胞则无表达,说明所构建的pcDNA3.1myc-his(-)-Sparc能够成功表达。结论:我们成功克隆了人Sparc cDNA,构建了其真核表达载体,并在HEK293细胞中得到有效表达,从而为进一步研究人SPARC的功能及其与肿瘤的关系奠定了基础。 相似文献
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目的:采用重组慢病毒系统,在过表达和抑制NDRG2 (N-myc downstream regulated gene 2)基因后,检测人结肠癌细胞系Caco-2的增殖情况.方法:分别采用NDRG2过表达慢病毒载体pLenti6-NDRG2和NDRG2干涉慢病毒载体pLKO.1-shNDRG2制备病毒并感染Caco-2细胞,经14天耐药的筛选,获得稳定感染的细胞株;采用Real time RT-PCR和Western blot方法明确NDRG2在稳转细胞株中的表达情况,同时采用MTT方法检测细胞的增殖能力,通过流式细胞仪检测细胞周期变化情况.结果:Real time RT-PCR和Western blot结果表明,在慢病毒pLenti6-NDRG2稳定感染的Caco-2细胞中,NDRG2表达上调;pLKO.1-shNDRG2稳定感染的Caco-2细胞中,NDRG2的表达下调.MTT实验结果表明,NDRG2过表达细胞株中细胞的增殖能力下降,而pLKO.1-shNDRG2慢病毒感染Caco-2后细胞的增殖能力明显增加;流式细胞术结果显示,过表达NDRG2使Caco-2细胞在G0/G1期细胞增多而S期的细胞减少,抑制细胞内源性NDRG2后G0/G1期细胞减少而S期细胞增多.结论:通过过表达和抑制NDRG2基因,验证了NDRG2作为抑癌候选基因能够有效抑制结肠癌细胞Caco-2的增殖. 相似文献
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目的检测肝癌细胞系中Yamanaka因子的表达,为肝癌细胞来源的诱导多能干细胞(iPS细胞)的建立和通过细胞重编程逆转肝癌的恶性表型提供实验依据。方法通过反转录PCR检测Huh7、SMMC-7721、HepG2等肝癌细胞系中4种Yamanaka因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的mRNA水平,通过Western印迹方法检测上述因子在蛋白质水平的表达,并构建上述因子的慢病毒表达载体,在肝癌细胞中过表达上述转录因子。结果4种Yamanaka因子在肝癌细胞系中均有不同程度表达,mRNA和蛋白质水平的检测结果一致。统计学分析显示,c-Myc的表达显著高于正常肝细胞。成功构建了Yamanaka因子的慢病毒表达载体,并诱导肝癌细胞呈现类似iPS细胞的形态。结论Yamanaka因子在肝癌细胞中有不同程度的内源表达,而外源高表达外源Yamanaka因子对于iPS细胞的诱导至关重要。 相似文献