大肠杆菌拓扑异构酶I结合重金属的特性及功能影响

【背景】大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ(Escherichia coli topoisomerase I,E.coli TopA)在DNA复制、转录、重组和基因表达调控等过程发挥关键作用。研究表明E.coli TopA只有结合锌离子才具有活性,然而E.coli TopA能否结合其他金属离子尤其是重金属离子,以及结合其他金属后是否具有活性,目前仍不清楚。【目的】探究大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ是否结合环境中常见重金属离子,研究重金属离子结合E.coli TopA蛋白后对其活性的影响。【方法】在分别添加有锌、钴、镍、镉、铁、汞、砷、铬、铅、铜离子的M9基础培养中表达、纯化出E.coli TopA蛋白,并对纯化得到的蛋白用电感耦合等离子体质谱仪进行相应金属离子含量的测定;利用表达E.coli TopA锌指结构的突变体蛋白鉴定重金属离子的结合位点;通过体外超螺旋DNA松弛实验测定不同金属结合E.coli TopA的拓扑异构酶活性;通过测定蛋白内源性荧光推测不同金属结合E.coli TopA的空间构象差异。【结果】E.coli TopA在体内除了能结合锌和铁之外,还能够结合钴、镍、镉3种离子,但是不能结合汞、砷、铬、铅、铜离子。钴、镍、镉结合形式的E.coli TopA,每个蛋白分子最多可以结合3个相应的金属离子,他们与TopA蛋白的结合位点也是位于3个锌指结构域,而且每个锌指结构域结合1个金属离子。此外,E.coli TopA结合钴、镍、镉离子后,其DNA拓扑异构酶活性并未受到影响,可能是由于钴、镍、镉离子结合形式的E.coli TopA蛋白,其空间构象与锌结合形式相比并未发生显著变化。【结论】由于DNA拓扑异构酶在维持细胞正常生理功能中发挥关键作用,研究表明E.coli TopA的功能不会受到常见重金属的干扰(不结合或者结合后活性无影响),这也有可能是大肠杆菌在进化过程中产生的对抗环境中重金属离子毒害作用的一种自我保护和耐受机制,具有重要的生理意义。     

卫氏并殖吸虫的畸形囊蚴及动物感染观察

扁囊并殖吸虫(Paragonimus asymmeticus)由陈心陶氏1977年发现于广东山区,从溪蟹体内分离出扁椭圆形的囊蚴,并感染家猫获得成虫,因而定为新种。此后,在浙江(黄文德1979)、福建(林宇光1980、刘恩诚1981、李友松1984)、江西(董苌安1981)、安徽(刘雪霞1982)等省相继发现。这类囊蚴往往与卫氏并     

253株金黄色葡萄球菌耐药现状分析

目的 了解医院金黄色葡萄球菌临床分布情况及其对常用抗菌药物的耐药率,为临床合理使用抗菌药物提供依据.方法 回顾分析医院2010年5月至2011年4月检出的金黄色葡萄球菌,采用VITEK-AMS全自动微生物分析仪进行菌种鉴定和药敏分析.结果 共检出金黄色葡萄球菌253株,菌株的主要来源为痰130株(51.4％)、血液39株(15.4％)、创面24株(9.5％);菌株主要科室分布前3位是神内科35株(13.8％)、ICU30( 11.8％)、脑外科26株(10.3％);其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA)为165株(65.2％),MRSA对多种抗菌药物耐药率＞70.0％,MSSA为88株(34.8％),对除青霉素、红霉素外的大多数抗菌药物敏感,未发现耐万古霉素菌株.结论 MRSA检出率高,耐药现状严重,应加强对金黄色葡萄球菌耐药性的监测,并根据药敏试验结果合理使用抗菌药物.     

金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因及抗生素耐药相关基因检测

目的 了解温州地区临床分离的金黄色葡萄球菌(SA)的耐药特点,探讨SA中耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类药物耐药基因及耐消毒剂基因(qacA)的存在情况.方法 采用聚合酶链式反应(PCR)法对SA进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、四环素类基因和耐消毒剂基因检测.结果 PCR结果显示94株SA中耐药相关基因检出率mecA 53.2％、aac(6’)/aph(2")68.1％、aph(3’)-Ⅲ 37.2％、tetM 53.2％和qacA 7.4％,其中59株MRSA的耐药相关基因检出率分别为mecA 83.1％、aac(6’)/aph(2")86.4％、aph(3 ′)-Ⅲ 42.4％、tetM 76.4％和qacA 8.5％.结论 多数SA菌株存在耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类等多种抗生素耐药基因,具有多重耐药特征,但尚未出现明显耐消毒剂状况.     

北京地区成人呼吸道感染病人中人偏肺病毒感染情况的初步分析

目的:了解北京地区成人呼吸道感染患者中人偏肺病毒(hMPV)的感染情况、流行分布和临床表现特点。方法:采集2010年5月至2011年4月北京地区成人呼吸道感染患者鼻咽拭子标本413份,利用巢式PCR法进行hMPV筛查,对PCR阳性片段进行核酸序列测定,确定hMPV感染基因型别;同时,分析hMPV感染的流行病学特点,并对感染阳性患者进行临床表现的初步分析。结果:413份鼻咽拭子标本中检出hMPV阳性4份(0.97%),分别存在于2010年8月、10月和2011年2月、4月,其中1例合并鼻病毒感染;感染患者临床表现主要是发热、鼻塞、流涕、头痛、咳嗽,有1例出现呕吐和腹泻;hMPV阳性片段系统进化分析发现这4例感染中的3例为B2型,1例为A2b型。结论:北京地区成人呼吸道感染患者中存在hMPV感染,其基因型为B2和A2b型。     

中国虎纹蛙脾微血管铸型的扫描电镜观察术

以扫描电镜的方法对中国虎纹蛙脾微血管铸型进行了观察,发现脾实质的白髓和红髓之间界限不甚清晰,脾血窦形态大小不一,相续连接成网,窦壁上有少数裂孔.脾微循环为闭锁和开放性循环共存的类型,且大部分为开放性循环.脾实质断面上有动静脉吻合的存在.     

布地奈德对哮喘大鼠气道嗜酸细胞影响机制的实验研究

目的：观察布地奈德（Bud）对哮喘大鼠嗜酸细胞（EOS）在气道局部浸润的影响。方法：复制哮喘大鼠模型,分为正常组（C组）、哮喘组（A组）和Bud组（B组）,用免疫组化检测肺组织NF-κBp65及Eotaxin活性;细胞分类计数法检测支气管肺泡灌洗液中的EOS。结果：A组肺组织NF-κBp65表达量均显著高于C组;B组肺组织NF-κBp65的表达均显著低于A组;B组BALF中EOS的绝对计数和百分比均低于A组;光镜下观察B组气道炎症较A组显著减轻。结论：Bud能抑制EOS在气道局部的浸润,减轻气道炎症。其机制可能与抑制哮喘大鼠肺组织NF-κB的活性从而减少Eotaxin的转录合成有关。     

利用海洋微生物降解有机磷农药MAP的研究

目的分离及筛选降解海水养殖区甲胺磷的降解菌,并确定最适的降解条件。方法从被有机磷污染的海水样中分离,以有机磷为唯一碳源反复驯化,分离筛选出1株高效降解甲胺磷的菌株M-1,并对其降解能力和所需条件进行测试。通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法从发酵液中分离纯化了有机磷农药降解酶。结果初步鉴定菌株M-1属于腊样芽胞杆菌。菌株M-1最适生长温度和pH分别为25℃和8．0。Zn^2＋（200mg／L）、Cd^2＋（50mg／L）与Pb^2＋（200mg／L）不影响菌株M-1对甲胺磷的降解作用,但Cu^2＋（50mg／L）、Cr^2＋（50mg／L）对菌株M-1有毒性作用。SDS-PAGE测得降解菌的有机磷农药降解酶的分子质量约为45kD。结论海洋微生物在甲胺磷污染的海水养殖区自净中起着重要作用。     

CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达

目的对大肠埃希菌所产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）进行基因克隆和重组表达,探讨其特性。方法以产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌12号菌总基因组DNA为模板,PCR扩增CTX-M-14,将其克隆入pUCm-T Vector载体后测定该核苷酸序列;再将基因编码区克隆到原核表达载体pET-28α,构建含CTX-M-14基因的重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳鉴定表达的酶蛋白后再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100％。大肠埃希菌BL21转化pET-28a／CTX-M-14重组质粒后,ESBLs试验为阳性。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白分子质量大约为30KD。结论成功表达重组的CTX-M-14型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。     

变形链球菌致龋抗原基因在乳酸乳球菌的表达

目的 克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中表达.方法 在实验中利用了分子克隆技术构建携带GbpB基因的重组原核表达质粒pNI1,将重组质粒转化乳酸乳球菌YF02株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的GbpB蛋白用SDS-PAGE进行鉴定.结果 成功克隆了GbpB功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中得到其融合蛋白的表达.结论 利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得乳酸乳球菌融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.