大肠杆菌拓扑异构酶I结合重金属的特性及功能影响

【背景】大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ(Escherichia coli topoisomerase I,E.coli TopA)在DNA复制、转录、重组和基因表达调控等过程发挥关键作用。研究表明E.coli TopA只有结合锌离子才具有活性,然而E.coli TopA能否结合其他金属离子尤其是重金属离子,以及结合其他金属后是否具有活性,目前仍不清楚。【目的】探究大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ是否结合环境中常见重金属离子,研究重金属离子结合E.coli TopA蛋白后对其活性的影响。【方法】在分别添加有锌、钴、镍、镉、铁、汞、砷、铬、铅、铜离子的M9基础培养中表达、纯化出E.coli TopA蛋白,并对纯化得到的蛋白用电感耦合等离子体质谱仪进行相应金属离子含量的测定;利用表达E.coli TopA锌指结构的突变体蛋白鉴定重金属离子的结合位点;通过体外超螺旋DNA松弛实验测定不同金属结合E.coli TopA的拓扑异构酶活性;通过测定蛋白内源性荧光推测不同金属结合E.coli TopA的空间构象差异。【结果】E.coli TopA在体内除了能结合锌和铁之外,还能够结合钴、镍、镉3种离子,但是不能结合汞、砷、铬、铅、铜离子。钴、镍、镉结合形式的E.coli TopA,每个蛋白分子最多可以结合3个相应的金属离子,他们与TopA蛋白的结合位点也是位于3个锌指结构域,而且每个锌指结构域结合1个金属离子。此外,E.coli TopA结合钴、镍、镉离子后,其DNA拓扑异构酶活性并未受到影响,可能是由于钴、镍、镉离子结合形式的E.coli TopA蛋白,其空间构象与锌结合形式相比并未发生显著变化。【结论】由于DNA拓扑异构酶在维持细胞正常生理功能中发挥关键作用,研究表明E.coli TopA的功能不会受到常见重金属的干扰(不结合或者结合后活性无影响),这也有可能是大肠杆菌在进化过程中产生的对抗环境中重金属离子毒害作用的一种自我保护和耐受机制,具有重要的生理意义。     

大肠杆菌YacG锌指结构的金属结合及功能特性

YacG蛋白是一种能够抑制大肠杆菌促旋酶（E.coli gyrase）活性的内源性小分子蛋白质,仅由65 个氨基酸残基组成。核磁共振(NMR)研究发现,YacG结构中含有1个Cys-X2-Cys-X15-Cys-X3-Cys序列的锌指结构域,然而其作用并不清楚。本研究发现,在添加外源锌或者铁的M9基础培养基中,表达并纯化得到分别含有锌和铁的YacG蛋白,而在同时添加铁和L-半胱氨酸的M9基础培养基中可以纯化得到含有铁硫簇的蛋白质。这表明,YacG不仅是一个锌指蛋白,也是铁结合或铁硫簇结合蛋白。定点突变实验发现,YacG锌指结构中的4个半胱氨酸残基突变后,其结合的锌、铁、铁硫簇的含量都显著下降。这提示,锌结合、铁结合以及铁硫簇结合的位点均位于锌指结构域中的4个半胱氨酸残基。体内YacG过表达实验显示,用IPTG在大肠杆菌体内诱导表达野生型YacG蛋白会导致其生长明显受到抑制,而过表达突变体蛋白（YacG-C12/28S）对其生长的抑制作用将会减弱。体外实验进一步发现,锌结合、铁结合以及铁硫簇结合形式的YacG蛋白对E.coli gyrase促DNA螺旋活性的抑制作用没有明显差别,但是锌指结构突变体蛋白（YacG-C12/28S）对gyrase活性的抑制作用显著减弱。这说明,完整的锌指结构对YacG抑制gyrase活性的功能具有重要作用。此研究有可能为gyrase抑制剂类抗生素药物的研发提供有用的线索。     

构建一种检测水中As3+的敏感型大肠杆菌

为构建一种敏感性强、特异性好的检测砷离子的大肠杆菌荧光报告菌株,本研究利用基因敲除技术,敲除了大肠杆菌中负责向胞外转运砷离子的ars B基因,构建对As~(3+)敏感的菌株;利用egfp基因作为报告基因,构建融合检测载体p ET28b-Pars-ars R-egfp。然后将检测载体p ET28b-Pars-ars R-egfp转化至ars B基因敲除菌中完成敏感型As~(3+)检测菌株的构建。接着对此微生物传感器进行了检测条件的优化,以及线性检测范围、最低检出限、特异性等性能的确定。研究结果表明,与利用野生大肠杆菌作为检测宿主相比,此敏感型砷检测菌株对检测As~(3+)的灵敏度有显著提高,最适检测As~(3+)浓度范围为0.013-42.71μmol/L,最低检出下限为5.13 nmol/L。因此,本研究利用基因敲除技术对大肠杆菌进行改造,成功地提高了砷检测微生物传感器的灵敏度,为重金属微生物传感器的优化研究工作提供了有用方案。