大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的过表达

目的构建携带大鼠瘦素(leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。方法提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用Spe I和EcoR V双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。结果测序证实瘦素基因与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5×1012vg/mL纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA-Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP感染鼠神经元细胞5d后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。结论成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。     

GDF5基因真核表达载体的构建及其在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达

目的克隆人软骨组织生长分化因子5（GDF5）基因及构建GDF5基因真核表达载体,观察其在恒河猴骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达情况。方法采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人胎儿软骨组织克隆hGDF5基因全长cDNA,插入pEGFP-C2载体,构建重组真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5。重组质粒脂质体介导法转染MSCs细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-PCR法检测目的基因表达。结果成功克隆人软骨组织GDF5基因和构建GDF5真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5,克隆在载体上的基因长度为1505bp,包含全部cDNA编码序列1505bp,测序显示与Genbank上的序列一致。重组质粒转染恒河猴MSCs细胞得到表达,绿色荧光蛋白在转染24h后开始表达,72h达高峰,然后表达逐渐减弱。转染后72h可检测到GDF5mRNA表达。结论人GDF5基因在恒河猴MSCs细胞的成功表达为应用恒河猴模型开展基于细胞的基因疗法修复骨和软骨损伤研究奠定了必要基础。     

西藏小型猪H-FABP基因的PCR-RFLP研究

目的研究西藏小型猪心脏脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因5’-上游区和第二内含子内的遗传变异。方法应用PCR-RFLP技术测定30头西藏小型猪H-FABP的基因型。结果（1）在5’-上游区的Hinf I-RFLP位点上,西藏小型猪表现出多态性,等位基因h的频率为0．80;（2）在在第二内含子内的Hae Ⅲ-RFLP位点上,西藏小型猪均为DD纯合子;（3）在第二内含子内的Hinf I＊-RFLP位点上,除一头猪表现为bb基因型外,其余猪都表现为BB基因型,等位基因B的频率为0．97;（4）除Hae Ⅲ-RFLP位点外,在其余位点上西藏小型猪均处于Hardy-weinberg不平衡状态。（5）在Hinf I-RFLP中,西藏小型猪表现为中度多态性（0．25〈PIC〈0．5）,而在其他位点的RFLP中表现为低度多态（PIC〈0．25）。结论可以利用西藏小型猪H-FABP基因5’-上游区的多态遗传标记来分析其与肌内脂肪的关系。     

人鼠肝组织嵌合体模型的制备

目的研究制备人鼠肝组织嵌合小鼠模型。方法将人骨髓干细胞直接注射到一定日龄胎鼠肝组织,每只注射移植约1×109人骨髓干细胞。用免疫组化对出生一定日龄移植小鼠肝脏进行甲胎蛋白免疫组织化学检测,检定分析人肝细胞在小鼠体内嵌合生长情况。结果移植人骨髓干细胞胎鼠出生2月龄、12月龄可检测到甲胎蛋白。结论将人骨髓干细胞移植小鼠肝脏内能够存活并分化成人肝细胞并能够长期存活。     

蝇蛆卵蛋白粉对昆明仔鼠生长发育的影响

目的研究含蝇蛆卵蛋白粉饲料对昆明（Kunming,KM）小鼠胎仔生长发育的影响。方法记录仔鼠各项生理变化指标,采用修订Fox方案检测各项生长发育指标。结果不同饲料组仔鼠断乳前窝重、仔鼠断乳后体重变化和食物利用率差异均无显著性;不同饲料组仔鼠躯体/生理发育指标：耳廓分离、睁眼、张耳和出毛时间差异无显著性,但雌性仔鼠阴道开口和雄性仔鼠睾丸下降较基础饲料组要早。低剂量饲料组的平面翻正所需时间、中剂量饲料组的负趋地性较基础饲料组短,而高剂量饲料组的平面翻正时间较基础饲料组长,差异均存在显著性。余各组仔鼠新生反射和感觉功能的各指标差异均无显著性。各组8周龄仔鼠部分脏器系数存在差异。但除雌性仔鼠阴道开口和雄性仔鼠睾丸下降两个指标外,上述有差异的指标数据差均在允许范围内。结论含蝇蛆卵蛋白粉饲料能够满足SPF级昆明小鼠生长发育的需要。     

人诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)系的建立

掌握建立人iPS细胞系(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的技术,以便为人肿瘤细胞重编程为iPS细胞建立技术平台.在人胚胎干细胞的培养条件下,通过携带Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个混合因子的慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(CCD-1079SK细胞),从而诱导成干细胞样的克隆.根据人胚胎干细胞的特性进行如下鉴定:克隆形态、碱性磷酸酶活性、核型和CCD-1079SK细胞来源的克隆拟胚体(embryoid bodies,EBs)形成及分化等.结果显示,在人胚胎干细胞的培养环境中,导入Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个因子的CCD-1079SK细胞产生了一株iPSC克隆,这株iPSC克隆在细胞形态、增殖能力、胚胎细胞特异性表面抗原以及基因表达与人胚胎干细胞相似,此外,iPSC克隆在体外悬浮培养中形成拟胚体并分化成3个胚层.人iPS细胞系的成功建立为利用iPS细胞技术开展肿瘤细胞重编程研究奠定了坚实基础.     

西藏小型猪部分脏器血管铸型标本制作

目的研究西藏小型猪内脏铸型,对西藏小型猪在相关生物医学研究上的应用提供参考。方法应用过氯乙烯和牙托粉单独或混合填充剂灌注方法制作西藏小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑铸型研究其血管分布规律。结果西藏小型猪内脏铸型外观完整美观,保持正常解剖状态、位置,充分显示和暴露主干的分支分布,各管道饱满,管道粗细适当,标本色泽鲜艳。结论通过单独或混合灌注过氯乙烯和牙托粉填充剂可以成功制作西藏小型猪铸型标本,所做标本显示的脏器血管分布情况对相关生物医学研究具有重要应用价值。     

戊巴比妥钠联用速眠新Ⅱ对西藏小型猪麻醉效果观察

目的观察联合应用速眠新Ⅱ和戊巴比妥钠对西藏小型猪的麻醉效果。方法采用速眠新Ⅱ（0.1mL/kg）肌内注射和3%戊巴比妥钠生理盐水溶液（0.2 mL/kg）静脉注射联合麻醉方法对15头行胚胎移植术的西藏小型猪进行麻醉,观察动物麻醉维持时间、镇痛效果、呼吸频率和心率变化及术后苏醒情况。结果80%（12头/15头）西藏小型猪初始量麻醉状态维持45 min以上,20%（3头/15头）西藏小型猪手术过程中追加麻醉。麻醉期间肌肉松弛效果好,动物呼吸和心率平稳。手术过程中西藏小型猪呼吸频率为（12-22）次/min,心率为（63-85）次/min,麻醉过程中未出现麻醉死亡,术后苏醒时间为30-60 min。结论速眠新和戊巴比妥钠混合麻醉效果好,且麻醉剂量较以往大幅减少,术后苏醒快。戊巴比妥钠联用速眠新复合麻醉对西藏小型猪是一种较理想的麻醉方法,且动物麻醉安全性高。     

西藏小型猪发情周期血清性激素和生化指标的变化规律

目的研究西藏小型猪发情周期内不同阶段血清性激素水平和生化指标的动态变化规律及其相关性。方法对6头雌性西藏小型猪在发情周期内的发情当天、第5天、第10天、第15天、再次发情时分别采血5 mL并分离血清,应用放射免疫法测定血清睾酮（T）、孕酮（P4）、雌二醇（E2）、促卵泡生成激素（FSH）、促黄体生成激素（LH）、泌乳素（PRL）;用自动生化仪测定血清钙（Ca）、镁（Mg）、磷（P）、碱性磷酸酶（ALP）、肌苷（Cre）、总胆固醇（CHO）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）。结果在发情周期不同阶段,西藏小型猪P4、CHO水平存在差异显著性;E2和Ca、Mg、CHO间,P4和CHO、TP、ALb间,PRL和P间均呈现显著性相关。结论在发情周期的不同阶段西藏小型猪的血清性激素水平和生化指标呈现规律性变化,部分指标间存在相关性。     

广州地区三种小型猪血液生理生化指标的比较

目的比较广州地区西藏小型猪、五指山小型猪和巴马小型猪血液生理生化指标的差异。方法全自动血液细胞和生化分析仪测定24个血液生理生化指标。结果 24个指标中,血红蛋白、白细胞、单核细胞、血细胞比容、葡萄糖指标的测定差异显著;淋巴细胞、中性粒细胞、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、血清总蛋白、血清清蛋白、血尿素氮、血肌酐指标的测定差异极显著。其中血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、血清总蛋白、血清清蛋白、血尿素氮、血肌酐指标以西藏小型猪最高,白细胞、淋巴细胞指标以五指山小型猪最高,而中性粒细胞、单核细胞、葡萄糖指标以巴马小型猪最高。结论三种小型猪血液生理生化指标的比较,为建立小型猪生物学特性数据库提供了理论依据。