医学留学生生物化学实验教学的实践与探索

随着国际交流与合作的日益频繁,留学生教育已成为中国高等教育的一个重要组成部分,生物化学实验是医学留学生的必修重要课程之一,因此,生物化学实验课的教学质量对学生的全面发展非常重要。通过对留学生生物化学实验教学的实践,根据留学生自身的特点和生物化学实验课程的特点,对我校留学生的生物化学实验教学进行了有益的实践与探索。结果显示留学生生物化学实验课的教学质量取得了显著提高。     

粘虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫(Mythimna separata(Walker))cDNA为模板,对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对GAPDH全长cDNA序列及推测得到的GAPDH蛋白序列进行分析.结果表明,获得的粘虫GAPDH基因cDNA序列长度为1 317 bp,其中包括80 bp的5′非编码区、238 bp的3′非编码区和999 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码一个332个氨基酸蛋白,具有GAPDH蛋白家族的两个功能结构域.该GAPDH蛋白理论相对分子质量为35.498 6 kDa,等电点为7.63,富含6种类型的特定功能位点.该蛋白序列与其他动物GAPDH蛋白序列具有77.4%～92.9%高度同源性.GAPDH基因表达量检测结果显示GAPDH在粘虫6种不同组织间表达量无显著差异(P0.05),表明GAPDH可作为研究粘虫功能基因表达量分析的可靠内参基因.该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为HM055756.     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

电场中的蛋白质结晶

人们一直致力于寻求提高蛋白质晶体质量的方法,利用电场诱导蛋白质结晶即是诸多方法中的一种。已有文献报道显示,电场对蛋白质结晶的影响是积极的。我们从直流电场、交流电场、内置电场、外置电场对蛋白质结晶的影响及相关结晶设备,电场中生长的蛋白质晶体质量的评估,电场中蛋白质结晶的原理及影响因素等方面,对已报道的电场中的蛋白质结晶研究工作进行了总结。     

血红素加氧酶-1重组载体的构建及在胃癌细胞中的初步研究

目的构建人血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）及其突变体的真核表达载体,观察其在胃腺癌细胞中HO-1表达和活性变化,研究HO-1活性变化的胃腺癌细胞对顺铂抗药能力的变化,为进一步研究HO-1对肿瘤细胞影响机制奠定基础。方法根据GenBank中HO-1cDNA序列设计引物,调取基因并克隆入pcDNA3．1（＋）质粒中,构建表达人野生型HO-1与突变型HO-1（HO-1G143H）的重组质粒。脂质体介导重组质粒转染胃腺癌细胞BGC823,用RT—PCR和Western印迹法分别检测细胞中HO-1mRNA的表达和蛋白表达水平,体外测定HO—1活性变化,应用顺铂进行体外抗药性实验。结果酶切鉴定和测序证实,HO-1真核表达载体构建成功;转染质粒后的BGC823,HO-1的mRNA和蛋白的表达水平明显上升;转入野生型质粒的细胞HO-1活性上升,转入突变型质粒的细胞HO-1活性下降;HO-1活性下降BGC823细胞抗顺铂杀伤能力增强。结论构建了HO-1野生型与突变型真核表达载体;将其转入胃腺癌细胞,引起了HO-1的mRNA和蛋白表达的增加和活性变化;体外实验表明,HO-1活性下降的BGC823细胞抗顺铂能力增强。     

三种苦瓜多糖的体外发酵特性比较研究

采用体外发酵技术评价分段醇沉提取的3种苦瓜多糖(MCP1、MCP2和MCP3,乙醇终浓度分别为45%、60%和75%)对三元猪盲肠食糜的发酵特性和发酵产物的影响。于不同发酵时间点记录产气量,48 h后检测发酵液pH值、NH3和短链脂肪酸(SCFA)含量。结果表明,MCP1和MCP2发酵动力学参数最优,显著优于葡萄糖和空白对照组(P0.05);MCP2和葡萄糖组pH值最低,MCP1和葡萄糖组的NH3含量最低;葡萄糖组的丙酸、异丁酸和SCFA总量显著高于其它各组(P0.05);MCP2的乙酸、异丁酸和SCFA总量显著高于其它多糖组(P0.05)。结果提示,MCP1和MCP2是2种理想的可被盲肠微生物利用的碳源,并可改变微生物发酵产生的SCFA含量与组成。     

菊粉和刺五加提取物对早期断奶仔猪生长性能、血液指标和肠道形态的影响

试验选用120头21日龄5.64kg左右的三元杂交断奶仔猪,分别饲喂基础日粮(对照组)、基础日粮+抗生素(抗生素组)和基础日粮+5%菊粉+0.1%刺五加提取物(实验组),试验期为14d,观察日粮中复合添加菊粉和刺五加(AS)提取物对早期断奶仔猪生长性能、血液生化指标和肠道形态的影响。试验结果表明,实验组与对照组相比,仔猪日增重(ADG)显著提高(P0.05),而料肉比(F/G)则显著降低(P0.05),但平均日采食量(ADFI)差异不显著(P0.05);实验组仔猪血清中血糖(GLU)、低密度脂蛋白(LDL)、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素氮(BUN)与对照组差异不显著(P0.05),但试验第14d,碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)浓度均显著高于对照组(P0.05);实验组仔猪十二指肠和回肠的隐窝深度显著高于对照组(P0.05),空肠和回肠的绒毛高度显著高于对照组(P0.05)。试验显示,日粮中添加菊粉和刺五加提取物对提高早期断奶仔猪的生长性能、改善小肠消化和吸收功能有重要作用。     

诱导温度调控华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶的表达及稳定性研究

比较了7 L发酵罐中不同诱导温度对华根霉前导肽脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达水平和稳定性的影响。通过实验表明在28℃条件下,最大酶活可以达到1412.5 U/mL,是30℃条件下的2.3倍,25℃条件下的1.3倍;而其产率可以达到12811 U/L·h~(-1),比产率达到82.6 U/g_(DCW)·h~(-1)。同时,在实验过程中发现诱导温度对目的蛋白的降解和聚合有重要的影响。通过对蛋白酶活性的测定和还原SDS-PAGE证实随着诱导温度的提高,蛋白酶活性急剧上升,从而导致由前导肽(37 kD)降解为成熟肽(30 kD)的降解作用的加剧。此现象在30℃条件下最为明显,在诱导84 h时前导肽已经全部降解为成熟肽。另外,通过非还原SDS-PAGE和分析表明随着诱导温度的提高也导致了二聚体的含量也逐渐增加。     

铬的营养生理功能

三价铬是人和动物必需的微量元素。铬在吸收后主要由转铁蛋白运输。在细胞内,4个三价铬离子与apochromodulin形成有活性的hopochromodulin。hopochromodulin除了可与胰岛素和/或胰岛素受体直接结合起作用外,还可以通过激活AMPK激酶来降低细胞膜胆固醇含量,改善细胞骨架功能,促进GLUT4移位,然后又通过激活p38MAPK激酶增强GLUT4的内在活性,从而促进葡萄糖吸收。铬也可以提高生长激素轴活性,并有降低动物机体脂肪沉积、增加肌内脂肪沉积、提高瘦肉率等作用。     

G蛋白偶联受体激酶5在稳定表达α-Synuclein的SHSY5Y细胞中的基因表达调控功能

目的观测G蛋白偶联受体激酶5（G protein-coupled receptor kinase,GRK5）在稳定表达hα-synuclein（人突触核蛋白）的SHSY5Y细胞的胞核、胞浆中的表达情况并对其在帕金森病中的可能作用进行研究。方法应用Western blotting、组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）活性检测技术以及shRNA干扰技术等对稳定表达hα-synuclein的SHSY5Y细胞中GRK5的表达及其亚细胞分布、胞核内GRK5蛋白的功能进行研究。结果发现GRK5蛋白在过表达hα-synuclein的细胞核以及细胞浆内均表达增加,胞核中的GRK5蛋白通过影响组蛋白去乙酰化酶的活性对bcl-2基因的转录和表达进行调控。结论帕金森模型中GRK5通过对bcl-2基因的表达进行调控发挥作用。