利用基因组改组技术提高短杆菌素产量及其培养条件优化*

短杆菌素是一种广谱抗菌肽,对细菌和真菌均有较好的抑制作用,具有潜在的抗生素替代价值。通过对侧孢短芽孢杆菌fmb70进行紫外诱变、亚硝基胍诱变、常压室温等离子体诱变,获得3株短杆菌素产量提高的诱变菌株。随后以诱变菌株为亲本进行两轮基因组改组,获得融合子F₂-24,其短杆菌素产量为(340.5±16.35) μg/mL,是野生菌株fmb70短杆菌素产量的1.92倍。融合子传代5代后,该菌株短杆菌素产量无明显差异,说明菌株稳定性良好。最后对该菌株产短杆菌素的培养基和发酵条件进行优化,优化后的培养基为:4%蔗糖、2%牛肉膏、0.5%氯化镁,发酵温度30℃、培养24 h、培养基初始pH6.0。优化后的短杆菌素产量可达(442.45±9.58)μg/mL,是初始培养条件的2.50倍。     

盐增强培养对弗氏链霉菌产新霉素的影响

目的: 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)作为氨基糖苷类抗生素新霉素的主要生产菌株,其新霉素B具有抗菌活性强、抗癌、抗HIV等作用,提高新霉素B的效价具有重要意义。方法: 在满足微生物正常生长所需盐离子的条件下,通过盐增强培养的方式向培养基中添加不同种类、浓度无机盐来改变细胞壁附近的理化特性、渗透压以及培养基中的碳氮比。结果: 不同无机盐对新霉素B效价影响程度由高到低为(NH₄)₂SO₄、NaCl、KCl、K₂SO₄;当添加60 mmol/L(NH₄)₂SO₄时新霉素B的效价达到最高为15 864 U/mL,而NaCl在80 mmol/L浓度时产量最高为7 429.7 U/mL,相比未添加无机盐分别提高3.8倍和0.82倍。在含有80 mmol/L的NaCl的发酵培养基中添加不同浓度的(NH₄)₂SO₄并定时取样检测其中氨基氮、还原糖、pH、TG、菌浓以及新霉素B效价的变化,发现60 mmol/L(NH₄)₂SO₄浓度下氨基氮、还原糖、TG的消耗速率加快,菌体比生长速率μ最大为0.097/h,新霉素B的合成加快且产量提高为17 399 U/mL,同时菌丝呈现出聚集变短的形态且产孢提前。结论: 盐增强培养方式既可以作为一种形态学工程手段,通过改变弗氏链霉菌的微观形态来促进次级代谢产物新霉素B产量的提高,同时也可以作为培养基优化策略来提高新霉素B的产量,这为进一步提高弗氏链霉菌中次级代谢产物产量的研究奠定了基础。     

不稳定EGFP细胞模型的构建及其在基因编辑体系评价中的应用*

目的:为了更好地评价基因编辑效率,满足高通量筛选应用中快速、高效的检测要求,在细胞上建立一个原位检测方法具有重要的意义。通过检测荧光蛋白信号强度的变化可以评价CRISPR系统在细胞中的基因编辑情况,然而这一方法的效率受限于荧光蛋白较长的半衰期。方法:将鸟氨酸脱羧酶降解结构域(含PEST序列)与EGFP融合,通过慢病毒系统感染HEK-293T细胞,获得了表达单拷贝、EGFP-PEST报告基因的稳转细胞系。结果:与EGFP相比,EGFP-PEST在细胞内的降解速度明显加快,荧光水平在4 h内显著降低。利用该模型比较了3种商品化脂质体介导的CRISPR/Cas9基因编辑效率,能够在2~4 d实现定性和定量评价。结论:这一模型能够快速、灵敏地指示基因编辑效果,可以用于不同CRISPR系统或新递送工具的高通量筛选和评价。     

利用CRISPR-Cas9技术失活黑曲霉中果胶酶基因及突变株性能评价*

我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需求的一种有效方案。构建一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术,可为构建高产单一性果胶酶的黑曲霉底盘菌株提供有效的基因编辑工具。首先敲除产果胶酶黑曲霉基因组上的pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株AnΔpyrG,并在AnΔpyrG菌株的pyrG基因位点定点整合Cas9基因表达盒和pyrG基因表达盒,构建组成型表达Cas9基因的黑曲霉菌株AnCas9,再构建含有gpdA启动子、锤头结构核酶、HDV核酶的稳定性表达sgRNA的pLM2-sgRNA质粒,建立CRISPR-Cas9基因编辑体系。利用该技术失活AnCas9菌株中的2个聚半乳糖醛酸酶基因4978020和4983861来检测构建的CRISPR-Cas9基因编辑效率并检测4978020基因功能缺失菌株的表型变化和产酶变化,结果表明果胶酶基因编辑效率大于50%,AnΔ4978020的表型和果胶酶酶活性与出发菌株均无明显变化。在黑曲霉中成功构建了高效的Cas9基因编辑技术,4978020基因功能缺失也不影响菌株表型,为构建高产单一性果胶酶黑曲霉底盘菌株奠定基础。     

玉米雄穗性状遗传结构与形成分子机制*

玉米为雌雄同株异花植物,其雄穗着生于植株顶部,雌穗腋生。雄穗一方面需产生足量花粉以保证雌穗授粉结实,另一方面由于对下部叶片的遮蔽作用和自身营养需求,其生长发育会同时影响叶片光合作用效率和能量分配,因此优化雄穗结构是提高玉米产量的重要措施之一。玉米雄穗性状包括雄穗分枝数、雄穗分枝长度、雄穗主轴长度、雄穗分枝总长度、雄穗分枝角度等,均为多基因控制的数量性状。自20世纪90年代,研究者开始利用数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)定位方法解析玉米雄穗性状遗传结构;随着玉米自交系B73等参考基因组释放,以及DNA微阵列、基因组重测序等高通量基因分型技术的日益成熟,全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)成为数量性状遗传研究的主流方法,目前已鉴定出大量玉米雄穗性状遗传位点。通过总结雄穗性状遗传定位研究结果,构建一致性图谱并挖掘定位热点区间,有助于进一步了解雄穗性状遗传结构特征及指导雄穗性状候选基因克隆。此外,通过对调控雄穗发育的已知基因进行功能分类,可为解析玉米雄穗发育的遗传网络和调控通路提供理论支撑。     

利用细菌人工染色体技术构建整合F基因的重组MDV疫苗株*

目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。     

种子无刺毛野生胡萝卜雄性不育材料的创制与鉴定

胡萝卜雄性不育使得胡萝卜杂交优势得以利用,而种子刺毛严重影响胡萝卜播种质量和效率。通常,需要在播种前去除胡萝卜种子的刺毛。胡萝卜种子无刺毛雄性不育材料对于胡萝卜遗传育种有重要的意义。本研究利用从武汉洪山地区野生胡萝卜(武野)筛选到的雄性不育材料(武野-不育)和筛选到的种子无刺毛材料(武野-无毛)进行杂交和后代筛选,获得了种子无刺毛的雄性不育材料(命名为武野-雄无毛)。武野-雄无毛材料为典型的瓣化型雄性不育,其叶片、叶柄、茎等表现出光滑无茸毛,植株颜色为深绿色。在育性线粒体基因上,武野-雄无毛只含有短片段的atp6基因,不含长片段的atp6基因。武野-雄无毛与武野及栽培胡萝卜黑田五寸杂交,种子均表现出无刺毛特征,且获得的杂交种发芽所需时间短于武野和黑田五寸。     

甘肃省大豆品种生育期组的划分及地理分布研究

甘肃省地域广大,地形复杂,气候多样,大豆品种资源丰富,但甘肃各地大豆品种生育期生态类型并不明确。本试验以25份MG 0~Ⅴ的北美大豆生育期组标准品种为对照,将从甘肃各地收集到的151个大豆品种在甘肃境内5个生态区进行生育期性状鉴定和生育期组划分。结果表明,甘肃地区种植的大豆品种的生育期组在MG 00和MGⅥ之间。在所鉴定的品种中,属MGⅣ的比例(44.37%)最高,其次为MGⅤ(29.14%)、MGⅢ(11.26%)、MGⅡ(4.64%)、MG 0(3.31%)、MGⅥ(3.31%)、MG 00(2.65%)和MGⅠ(1.32%)。归属于MGⅢ的品种主要分布在河西灌区,占该区域参试品种总数的47.62%;归属于MGⅣ的品种主要分布在中部地区和陇东旱塬区,占中部地区参试品种总数的56.67%,占陇东旱塬区的63.83%;归属于MGⅤ的品种主要分布在陇南地区,占该区域参试品种总数的61.40%。根据甘肃不同地区可成熟的最晚熟大豆品种的生育期组与当地经度、无霜期建立回归方程,推断甘肃省大豆各生育期组的地理分布区间,提出了基于生育期组的甘肃省大豆品种引种方案,以期为甘肃地区大豆育种和品种布局提供科学依据。     

宝天曼国家级自然保护区三种林型土壤的亮孢黏菌多样性

黏菌是土壤原生生物的重要组成部分,但其群落组成与多样性格局信息目前还不全面。本研究采用18S rRNA基因高通量测序的方法,研究了宝天曼自然保护区内落叶阔叶林、针叶林和针阔混交林土壤中的亮孢黏菌多样性,并通过多元统计方法分析了其群落结构与土壤环境因子之间的关系。结果表明,30份土壤样品中共获得26个亮孢黏菌的可操作分类单元（OTUs）,隶属团毛菌目Trichiales下的7个属。4个OTUs可注释到种,分别为球圆团网菌Arcyria globosa、蛇形半网菌Hemitrichia serpula、刺丝团毛菌Trichia scabra和高山团毛菌Trichia alpina。亮孢黏菌群落α多样性在不同林型间有显著差异,其中在针叶林最高,落叶阔叶林最低。不同林型土壤的亮孢黏菌群落结构也显著不同,冗余分析显示,不同林型间黏菌群落结构差异与土壤含水量、碳氮比、有效钾和有机碳显著相关,但总体土壤环境因子对群落结构差异的解释量有限,占比10.18%。本研究丰富了土壤黏菌多样性信息和生态分布理论。     

广西凭祥红锥-马尾松混交林菌根际微生物群落结构

以广西凭祥红锥-马尾松混交林中红锥和马尾松为研究对象,采集林下外生菌根和根际土壤,利用高通量测序分析该混交林下的菌根际微生物群落结构。结果表明,红锥、马尾松菌根际优势真菌为红菇属Russula、被孢霉属Mortierella、乳菇属Lactarius、鹅膏属Amanita、拟锁瑚菌属Clavulinopsis、丝盖伞属Inocybe、锁瑚菌属Clavulina和木霉属Trichoderma,其中,Russula为绝对优势类群,菌根和根际中共生真菌均以外生菌根真菌为主。而优势细菌主要为常见菌根辅助细菌,如伯克霍尔德氏菌属Burkholderia、假单细胞菌属Pseudomonas、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium、根瘤菌属Rhizobium和土壤杆菌属Agrobacterium,除芽孢杆菌属Bacillus外,菌根内菌根辅助细菌均高于根际。PICRUST功能分析表明红锥和马尾松菌根中部分膜运输通路（ABC transporters、transporters和secretion system ABC）和信号转导通路（two-component system）的丰度高于根际。α多样性分析表明,菌根和根际微生物多样性存在显著差异,马尾松菌根、根际真菌群落多样性显著高于红锥;β多样性分析表明两树种菌根和根际分别具有相似的微生物群落结构。优势菌群和土壤环境因子的RDA分析表明,土壤pH、全磷和全钾是影响菌根际菌群结构的主要环境因子。