基于双重芯片式数字PCR快速鉴定KPC型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的方法

【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用,致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增,产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因bla_KPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因bla_KPC保守序列设计特异性引物和探针,确定双重芯片式数字PCR同时对yhaI和bla_KPC两个基因核酸浓度绝对定量的检测范围、检出限和最佳实验体系,并进行方法特异性、灵敏度、重复性分析及临床菌株的检测。【结果】双重芯片式数字PCR检测灵敏度比双重实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级,在两基因同时检出的情况下,最低检出限分别为3.74 copies/μL (yhaI基因)和1.93 copies/μL (bla_KPC基因);优化后的双重芯片式数字PCR对参考菌株检测特异性的结果与双重实时荧光定量PCR结果一致;利用优化后的双重芯片式数字PCR方法共检测58株临床菌株,其中肺炎克雷伯菌43株,属肺炎克雷伯菌且含有bla_KPC基因的菌株13株,这与质谱及耐药谱检测结果一致。【结论】利用双重芯片式数字PCR技术建立了产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的绝对定量检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、准确度好,可用于检测具有碳青霉烯酶基因bla_KPC的肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析,也为产其他类型碳青霉烯酶的病原菌检测提供了新的技术参考。     

幼虫密度对桑螟生长发育和繁殖的影响

【目的】本研究旨在了解桑螟Diaphania pyloalis幼虫不同饲养密度对其生长发育和繁殖的影响。【方法】本研究测定了室内同一条件下5个幼虫密度(130, 650, 1 300, 1 950和2 600头/m²)下桑螟生长发育和繁殖指标,包括发育历期、幼虫存活率、化蛹率、成虫羽化率、蛹重、产卵期、单雌产卵量等。【结果】幼虫密度对桑螟的生长发育和繁殖均产生不同程度影响,幼虫密度偏低或偏高都不利于桑螟生长发育和繁殖。其中以1 300和1 950头/m² 2种幼虫密度下的桑螟幼虫生长发育和成虫繁殖状态均最佳且两密度下各项指标无明显差异,1 300头/m²密度下,桑螟的幼虫历期、蛹历期和成虫历期分别为11.32, 6.33和5.31 d; 1 950头/m²密度下,桑螟的幼虫历期、蛹历期和成虫历期分别为11.50, 6.00和5.47 d。1 300头/m²幼虫密度下,桑螟化蛹率、成虫羽化率和幼虫存活率分别为86.67%, 100%和86.67%, 1 950头/m^2<...     

光枝勾儿茶内生真菌多样性及抑菌活性研究

为探索贵州苗药光枝勾儿茶内生真菌类群特征、分布部位及其抑菌活性,该研究采用传统方法对贵州省贵阳市和黔西市光枝勾儿茶内生真菌进行分离,并基于分子生物学及统计学对其分类地位进行鉴定及多样性评价,最后通过微量肉汤倍比稀释法筛选具有抑菌活性的菌株。结果表明:(1)从光枝勾儿茶中分离到191 株内生真菌,隶属于3 个门5 个纲10 个目15 个科19 个属,优势属为叶点霉属(Phyllosticta)、间座壳属(Diaporthe)、葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)和刺盘孢属(Colletotrichum)。(2)黔西光枝勾儿茶内生真菌香农-维纳多样性指数(H''_Q=2.112)较贵阳(H''_G=1.801)高,索伦森相似性指数Cs_G-Q为0.923,不同组织香农-维纳多样性指数为茎(H''_S=2.004)>根(H''_R=1.764)>叶(H''_L=1.654)>果实(H''_F=1.473),茎和叶内生真菌的索伦森相似性最高(Cs_S-L=0.667)。(3)筛选出的21株内生真菌对供试菌大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和沙门氏菌(Salmonella enterica)具有抑菌效果,其中Diaporthe sp. QX4G6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为12.5、6.25、12.5 mg·mL^-1,最小杀菌浓度分别为12.5、6.25、12.5 mg·mL^-1。以上研究结果揭示了光枝勾儿茶蕴藏丰富的内生真菌资源,不同地区及组织内生真菌类群组成有差异,多个分离菌株具有抗菌活性,为光枝勾儿茶内生真菌天然抗菌药物或药源研发奠定了基础。     

基于N蛋白单克隆抗体的小反刍兽疫病毒抗体检测胶体金试纸条的研制

本研究旨在建立一种简便、快捷、可直观检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体的检测方法。将pET-32a-N重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,以纯化的PPRVN蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)筛选及亚克隆,获得了抗PPRV N蛋白的单克隆抗体。将PPRV N蛋白分别作为金标抗原及检测线(T线)包被抗原、单克隆抗体作为质控线(C线)包被抗体,组装成检测PPRVN蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条。结果显示：成功获得1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为1F1;间接ELISA检测1F1腹水效价为1:128000;亚类鉴定结果为IgG1,轻链为kappa链。Westernblotting结果显示,1F1能与PPRV N蛋白特异性结合;间接免疫荧光(indirect immunofluorescent ass...     

新型免疫抑制剂brasilicardin A的研究进展

Brasilicardin A (BraA)是从致病性放线菌巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis) IFM 0406中发现的具有显著免疫抑制作用(IC50=0.057μg/mL)的二萜糖苷类化合物。BraA发挥免疫抑制活性的作用机制与现有临床常用的免疫抑制剂不同,BraA通过抑制氨基酸转运体L系统的转运进而影响T-淋巴细胞对氨基酸的摄入而发挥免疫抑制作用。相比目前已知的免疫抑制剂环孢菌素A、子囊霉素和他克莫司等,BraA在小鼠混合淋巴细胞反应中显示低毒、高效的优势。因此,BraA作为新型的免疫抑制剂,极具开发潜力,已成为全球免疫抑制剂发现新领域。但其结构复杂、合成困难,原菌种产率低且具有致病性,BraA及其类似物的获得已成为此类新型免疫抑制剂研究的瓶颈。本文综述了BraA的分子特征、药理活性、作用机制、目前获得的BraA类似物和衍生化方面的研究进展,以期为BraA及其类似物的高效生产提供参考。     

蛇足石杉内生真菌产黄青霉菌MT-40中xanthocillin类似物生物合成基因簇的挖掘及鉴定

Xanthocillin具有显著的抗菌活性,结构中含有独特的异腈基。本文通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)MT-40基因组的测序分析,利用本地BLAST等生物信息学分析工具挖掘具有合成xanthocillin类似物潜力的基因簇,结合米曲霉(Aspergillus oryzae)NSAR1异源表达技术实现基因簇中关键基因的功能鉴定。结果成功从内生真菌P.chrysogenum MT-40中发现一个合成xanthocillin类似物的生物合成基因簇(命名为for),for基因簇中的关键生物合成基因forB编码的异腈基合成酶可以催化合成2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid,基因forG编码的P450酶可以催化2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid的二聚化生成xanthocillin类似物N,N′-(1,4-bis(4-hydroxyphenyl)buta-1,3-diene-2,3-diyl)diformamide。本文研究结果为进一步从真菌中发现xanthocillin类似物提供参考。     

核纤层蛋白B1通过影响端粒酶活性调控肝癌细胞生长

核纤层蛋白B1(nuclear lamina protein B1,LMNB1)高表达于肝癌组织中,通过敲低LMNB1探讨其对肝癌细胞增殖的影响及其机制。利用siRNA在肝癌细胞中敲低LMNB1,Western blotting检测敲低效果,使用端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol assay,TRAP)检测其端粒酶活性变化。利用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测其端粒长度变化。并通过CCK-8、克隆形成、Transwell、划痕实验检测其生长,侵袭和迁移能力变化。利用慢病毒系统构建稳定敲低LMNB1的HepG2细胞,检测其端粒长度及端粒酶活性变化,采用SA-β-gal衰老染色检测细胞衰老情况,通过裸鼠皮下成瘤实验及对肿瘤后续的组化染色,SA-β-gal衰老染色,端粒荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测其对成瘤性的影响。最后利用生物信息分析的方法寻找LMNB1在临床肝癌组织中的表达情况,及其与临床分期、病人生存期的关系。HepG2和Hep3B中敲低LMNB1后端粒酶活性显著降低,细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低,细胞和裸鼠成瘤实验证明稳定敲低LMNB1后端粒酶活性降低的同时端粒长度缩短,细胞发生衰老,此外细胞成瘤性降低,Ki-67表达降低,生物信息分析结果显示,LMNB1高表达于肝癌组织,且与肿瘤分期和患者生存相关。LMNB1在肝癌细胞中过表达,其有望成为评估肝癌患者临床预后的指标和精准治疗的靶点。     

嵌合抗原受体T细胞治疗的现状与展望

肿瘤严重威胁着人类健康,当前肿瘤传统的治疗方法有手术治疗、化疗、放疗和靶向药物治疗等。近年来,肿瘤免疫治疗,尤其是嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR） T细胞免疫疗法在基础研究与临床应用中蓬勃发展,并在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大成功。然而,大量研究显示,细胞免疫治疗后可出现不同程度的毒副反应,且部分患者缓解后再次复发。因此,了解细胞治疗面临的挑战与局限性,寻找解决的办法,对继续发挥细胞免疫疗法的潜能具有重要意义。本文就免疫细胞的CAR结构、病毒载体的选择、细胞治疗面临的挑战及前景进行综述。     

基于叶绿体基因组数据的芸香科属间系统发育初步分析（专题约稿）

该研究在人工控制水分条件下,设置3个干旱胁迫处理,选用3个主栽油菜品种‘陇油10号’、‘陇油2号’、‘青杂5号’幼苗进行盆栽试验,测定干旱胁迫条件下叶片相对含水量、叶绿素含量、光合气体交换参数及叶绿素荧光参数等指标,考察各指标在干旱胁迫过程中的变化特征,并通过主成分分析(PCA)和隶属函数法评价品种的抗旱性及其主要响应因子,以揭示西北地区油菜幼苗响应干旱胁迫的光合调控机制。结果表明：(1)各品种油菜幼苗的叶片相对含水量(RWC)均随干旱胁迫程度的递增而逐渐降低,最大水分亏缺(WSD)却逐渐上升。(2)各品种油菜幼苗叶片的叶绿素a含量、叶绿素总含量随着干旱胁迫程度的递增而先增加后递减,且同一种幼苗在不同处理间差异显著。(3)各品种油菜幼苗叶片的净光合速率(P_n)、水分利用效率(WUE)、单株生物量、气孔导度(G_s)、胞间CO₂浓度(C_i)均在受到干旱胁迫时迅速降低,且同一品种幼苗在不同处理间差异显著,而其叶片蒸腾速率(T_r)在干旱胁迫下无显著变化。(4)各品种油菜幼苗叶片光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(NPQ)随着干旱胁迫程度的递增先增加后递减,最大光化学效率(F_v/F_m)和电子传递速率(ETR)在受到干旱胁迫时迅速降低,且同一品种幼苗在不同处理间差异显著。(5)主成分分析结果表明,在油菜幼苗受到干旱胁迫时RWC、C_i、G_s、P_n、WUE、叶绿素总含量、叶绿素a含量和NPQ起主要调控作用;隶属函数法综合评价表明,3个品种油菜幼苗耐旱能力由高到低依次为‘陇油10号’＞‘陇油2号’＞‘青杂5号’。     

干旱胁迫下红砂幼苗非结构性碳水化合物动态变化特征

该试验以荒漠区主要建群种红砂幼苗为研究对象,设置适宜水分(CK)、轻度干旱(MD)、中度干旱(SD)和重度干旱(VSD)4个胁迫处理(即田间持水量的80%、60%、40%和20%),采用盆栽控水试验,分别测定干旱胁迫15、30、45和60 d时红砂幼苗的叶、茎、粗根和细根中非结构碳水化合物(NSC)及其组分的含量,分析不同胁迫强度下不同干旱持续时间红砂幼苗NSC的动态变化及各组分差异,以揭示红砂NSC对干旱胁迫的响应机制。结果表明:(1)干旱胁迫强度和胁迫持续时间对红砂幼苗不同器官NSC及其组分均有显著影响,其中胁迫持续时间对NSC动态变化的影响尤为显著。(2)干旱胁迫初期,红砂叶中的NSC含量呈下降趋势,而茎中的NSC含量呈上升趋势,粗根和细根中NSC含量在各胁迫处理下基本保持稳定。(3)干旱胁迫后期,红砂叶和茎中的可溶性糖、淀粉和NSC含量逐渐增加,而粗根和细根中的淀粉和NSC含量呈下降趋势(中度干旱除外),且这一时期重度干旱处理下各器官可溶性糖和NSC的含量明显高于CK。研究发现,重度干旱胁迫能显著诱导提高红砂幼苗不同器官中的NSC含量,并通过分解根中淀粉和增加叶片中可溶性糖含量的方式来调节细胞渗透势平衡,以维持细胞活力,进而保持红砂在干旱胁迫后期的存活。