rhIL-12二硫键、N-糖基化位点及C端氨基酸序列分析

重组人白细胞介素12（rhIL-12）是一种已经用于治疗肿瘤,寄生虫、病毒性感染及造血障碍等疾病研究的异二聚体糖蛋白。结构确证是质量控制的重要内容,此研究对CHO细胞表达的rhIL-12二硫键配对方式、N-糖基化位点以及C端氨基酸序列进行了分析,使用Trypsin、Chymotrypsin和Glu-C三种酶分别对rhIL-12进行非还原酶解,尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二硫键相连的肽段,然后使用LC-MS/MS对酶解后的肽段样品进行分析,确定了rhIL-12样品中存在和理论配对方式相符的7对二硫键。将rhIL-12二硫键还原后并烷基化修饰保护,分别采用Trypsin,Chymotrypsin和GluC进行酶解,并用LC-MS/MS对酶解后肽段进行了质谱肽图及C端氨基酸序列分析,确定了rhIL-12 p35亚基C端氨基酸序列的8个氨基酸、p40亚基C端氨基酸序列的15个氨基酸。对rhIL-12样品还原及烷基化后用Trypsin变性酶解,所得肽段在H₂O及H₂¹⁸O水中分别用PNGase F糖苷酶处理酶切产物。并通过二级质谱分析脱糖后糖肽段分子量变化,从而确定了rhIL-12的3个N糖基化修饰位点,分别为p35亚基的71位和85位以及p40亚基的200位。通过建立酶解结合二级质谱鉴定的方法,证明了新药rhIL-12的二硫键位点、C端氨基酸序列和糖基化位点与理论一致。     

重组人载脂蛋白AI米兰变体在大肠杆菌中的高效表达*

通过大肠杆菌表达系统来生产重组人载脂蛋白AI_M(proapolipoprote in AI_M,proapoAI_M)。整个proapo AI_M基因被分成两个片断,通过RT-PCR的方法合成。在对该基因的上游部分进行改造后,插入到表达载体pBV220中进行表达。蛋白的表达量达到45%左右,蛋白的表达形式为包涵体。包涵体通过疏水柱进行柱上复性,复性后的蛋白具有良好的生物活性。     

真光层深度的遥感反演及其在富营养化评价中的应用

真光层深度直接影响水体中浮游植物的分布和初级生产力以及水体生态环境,是水生态研究的一个重要参数.利用2006年10月24日～11月2日太湖水下实测光谱数据和光合有效辐射(PAR)数据,通过数据的处理和分析,尝试建立真光层深度与水面以下遥感反射率的关系模型,并利用真光层深度与透明度的关系,建立水体富营养化真光层深度评价模型.研究结果表明:真光层深度与归一化遥感反射率具有很好的相关性;选用特定波段的归一化反射率作为变量,建立两者的关系模型能较好的反演真光层深度,所建立的模型算法中,指数模型拟合方程的综合效果好于其他模型,波段比值算法反演精度要好于单波段算法;利用利用真光层深度进行富营养化评价具有一定的应用价值,利用该模型对太湖水体进行富营养化评价,得出太湖西部湖区大部分已富营养化,东部湖区处于中营养化和轻度富营养化状态.     

人参皂甙对气虚型血管损伤中COX-2和iNOS相互作用的影响

探讨气虚型大鼠血管内皮损伤中COX-2和iNOS的蛋白水平及其相互作用,以及人参皂甙的防治作用.用高L-蛋氨酸复制SD大鼠血管内皮损伤,并附以负重游泳法制造气虚实验模型.应用Western blotting分析内皮损伤相关的COX-2和iNOS蛋白水平的变化,免疫共沉淀和激光共聚焦显微镜技术,探讨两者的相互作用,光镜和电镜分析血管内皮的病理变化.结果显示:模型组、COX-2和iNOS蛋白含量显著增高,并存在明显的相互作用,与血管内皮的病理损伤相一致;与模型组相比,人参皂甙组COX-2和iNOS的蛋白含量降低,且两者的相互作用减弱.气虚型大鼠血管内皮损伤中,COX-2和iNOS蛋白含量增高,且两者之间的相互作用增强,加重血管内皮损伤,人参皂甙能够纠正这些异常,起到保护血管内皮免受损伤的作用.     

PCR-DGGE技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)在微生物生态学领域有着广泛的应用。研究采用化学裂解法直接提取出不同农田土壤微生物基因组DNA,并以此基因组DNA为模板,选择特异性引物F357GC和R515对16S rRNA基因的V3区进行扩增,长约230bp的PCR产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分离后,得到不同数目且分离效果较好的电泳条带。结果说明,DGGE能够对土壤样品中的不同微生物的16S rRNA基因的V3区的DNA扩增片断进行分离,为这些DNA片断的定性和鉴定提供了条件。与传统的平板培养方法相比,变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术能够更精确的反映出土壤微生物多样性,它是一种有效的微生物多样性研究技术。     

枸杞抗羟脯氨酸细胞变异系筛选及其耐盐特性的研究

试验以枸杞(Lycium barbarum L.)成熟胚诱导的胚性愈伤组织为材料研究了：(1)^60Co—γ射线诱变处理对愈伤组织的影响;(2)耐羟脯氨酸(HYP)愈伤组织变异系的筛选;(3)耐HYP愈伤组织变异系的耐盐性及稳定性分析;(4)耐HYP愈伤组织变异系生理生化特性;(5)变异系的分化和再生苗的生理生化特性。初究结果表明：由胚性愈伤组织经30Gy的^60Co—γ辐射处理,在含16mmol／L HYP选择培养基和无HYP培养基上交替培养4代,分离出耐HYP的愈伤组织变异体;该变异体游离脯氨酸含量比对照高3．3倍,其再生植株叶片游离脯氨酸比对照高13．5倍。     

拮抗放线菌S24的鉴定及其对黄曲霉的抑制作用

以黄曲霉(Aspergillus flavus)为靶标, 从泰山土壤中分离获得一株对黄曲霉、赭曲霉、黑曲霉等粮食和饲料中常见的曲霉菌有高效拮抗活性的放线菌S24。根据其形态特征、培养特征、理化性质、细胞壁组份及16S rRNA 序列分析, 初步判定该菌株为链霉菌属中的白网链霉菌(Streptomyces albireticuli)的近似种; 该菌株抗菌谱广, 胞外抗菌物质对热稳定, 100°C加热100 min抗菌活性无明显变化; 96孔板法测得其胞外抗菌物质粗提物对黄曲霉的最小抑/杀菌浓度(MIC/MFC)分别为19.53 μg/mL和39.06 μg/mL。     

温度对发头裸腹溞生殖能力的影响

在实验室培养条件下饲以充足食物,对不同温度下发头裸腹溞(Moina irrasa)的最大生殖能力进行了研究。结果表明：在5个不同温度（(15±1)℃、(20±1)℃、(25±1)℃、(30±1)℃、(35±1)℃）条件下,发头裸腹溞最大生殖个体的体长可达1.93mm;性成熟所需的时间分别为：4.0d、2.36d、1.40d、1.31d和1.0d;各成龄期平均产仔量为：(24.78±4.29)个、(19.1±2.42)个、(26.25±5.71)个、(27.62±2.72)个和(19.47±3.29)个;平均累计产仔量则为：(87±26)个、(159±39.5)个、(239±21.9)个、(130.9±36.1)个、(81.6±17.0)个。发头裸腹溞的最适生殖温度在25－30℃之间,25℃时其累计生殖量最大,为(239±21.9)个。生殖的极限温度最高约为38℃,生活的临界温度最高在40℃。温度低于11℃时发头裸腹溞已不适合进行孤雌生殖。在不同温度条件下,发头裸腹溞性成熟所需的时间与水温的关系可用回归方程表示为：h=7231.4t-1.6167。本文亦对同属中几个相近种的生殖能力及相关生物学现象进行了探讨。     

RNA干扰抑制TGF-βⅡ型受体的表达

目的:观察针对TGF-βRⅡ的干扰RNA对TGF-βRⅡ表达的抑制作用,探讨RNA干扰TGF-βRⅡ的方法对肾问质纤维化的抑制作用.方法:PCR方法扩增TGF-βRⅡ的cDNA序列,将全长的TGF-βRⅡ cDNA插入pcDNA3中,构建TGF-βRⅡ的真核表达栽体,酶切、测序及间接免疫荧光鉴定;根据TGF-βRⅡ的设计针对TGF-βRⅡ的干扰RNA,构建针对TGF-βRⅡ的RNA干扰质粒pSUPER-TGF-βR Ⅱ并进行酶切及测序鉴定;脂质体介导针对TGF-βR Ⅱ的RNA干扰质粒和TGF-β RⅡ的真核表达载体共转染293T细胞,western-blot检测293细胞内TGF-β R Ⅱ的表达.结果:pcDNA3-TGF-βRⅡ测序结果显示TGF-βRⅡ基因未发生突变.间接免疫荧光检测TGF-βRⅡ在293T细胞内的表达;测序显示RNA干扰质粒pSUPER-TGF-βRⅡ序列正确,RNA干扰质粒明显抑制293T细胞内TGF-βRⅡ的表达.结论:成功构建了TGF-βRⅡ的真核表达载体及针对TGF-βRⅡ的RNA干扰质粒,RNA干扰质粒能够抑制TGF-βRⅡ的表达,为进一步研究针对TGF-βRⅡ的RNA干扰对肾纤维化的预防及治疗作用提供有用工具.     

不同性别类型黄瓜ACC合酶基因的单核苷酸多态性标记和酶切扩增长度多态性标记

黄瓜的性别分化与乙烯密切相关,1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶.根据ACC合酶基因家族的保守序列设计PCR引物,从8个不同性别类型(雌雄同株、强雌性和全雌性)黄瓜品种中克隆了长度为1188bp的ACC合酶基因(CS-ACS2)片段(GenBank登记号为:DQ115884～DQ115886和DQ115875～DQ115879).经测序分析,3个雌雄同株性别类型品种的序列完全相同.与之相比,5个强雌性和全雌性品种中存在8个单核苷酸多态性(SNPs)标记,SNPs标记为4个A←→G和4个T←→C之间的转换.在8个SNPs中,有1个SNP位于内含子区域,其余7个SNPs都位于外显子区域.在7个位于外显子区域的SNPs中,有3个为非编码区的SNPs,4个为cSNPs.而在4个cSNPs中,有3个导致了编码的氨基酸序列改变.研究结果表明,与雌雄同株性别类型相比,雌性系中均存在单核苷酸的变异,这提示ACC合酶基因CS-ACS2的单核苷酸变异可能与黄瓜雌性系的发生形成有关.另一方面,根据SNP多态性还发展了一个酶切扩增长度多态性(CAPS)标记C-MT700.利用CAPS标记C-MT700能将强雌性优良品种MT-705与其他黄瓜品种相区别,该标记在黄瓜育种生产上具有一定的应用价值.此外,研究获得的SNPs标记和CAPS标记丰富了黄瓜的分子标记种类.