多联PCR诊断技术的建立及其对多种动物病毒的检测

多联PCR是指用多对引物在同一反应体系中对多个目的基因片段同时进行扩增,它能够捕获较多的核酸信息,完成较为复杂的核酸分析。与单项PCR相比,具有省时、省力、降低成本及减少污染等优点。目前,该项技术已在遗传疾病诊断、病原分析、连锁分析及法医学研究等方面逐步得到应用。 病毒性猪繁殖障碍是危害我国养猪业的一类重要传染病,主要是由狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和日本乙型脑炎病毒(JEV)等     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

由反转录病毒载体转移的马立克病毒糖蛋白D基因在感染细胞中的表达

用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ将已分离和克隆的马立克氏病病毒糖蛋白Ｄ基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出,克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载全ＰＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用ＣｌａＩ再次ｇＤ基因切出,构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ,并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）,转染后第９天收集细胞上     

大鼠β乳酪蛋白基因调控区的克隆和序列分析及乳腺定位表达载体的构建

将大鼠β乳酪蛋白的调控序列克隆于ｐＧＥＭ－４Ｚ,用ＳＰ６、Ｔ７正反向引物进行序列分析,证实其正确之后将该调控序列克隆于真核表达载体ｐＳＶＬ中,构建成功了乳腺定位表达载体。同时在其下游插入了荧光素酶报道基因,用于在乳腺细胞表达调控的研究。     

猪瘟病毒兔化弱毒株cDNA片段的克隆及序列分析

猪瘟是猪最重要的传染病之一,往往给养猪业造成重大经济损失,猪瘟的病原为猪瘟病毒（ＨＣＶ）,属黄病毒科,瘟病毒属成员,其基因组为单股正链ＲＮＡ,长度为１２３ｋｂ,仅含有一个大的开放阅读框架,编码一个含３８９８个氨基酸残基（ＡＡ）的多聚前体蛋白［１,２］。目前已经定位的蛋白有５种,即Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅ０、Ｅ１和Ｅ２,它们均由ＨＣＶＲＮＡ５′端所编码,除Ｎｐｒｏ外,其它４种均为ＨＣＶ的结构蛋白［３］。Ｎｐｒｏ为具有自我催化功能的蛋白水解酶,也是多聚蛋白Ｎ端的第一个蛋白水解酶,分子量为２３ｋＤ,Ｃ为构成…     

中国猪瘟兔化弱毒(兔血源毒)NS35′端基因的克隆与序列分析

猪瘟(Hog Cholera, HC;或称为Swine Fever, SF)是猪最重要的传染病之一,猪瘟病毒(HCV 或SFV)归类于黄病毒科瘟病毒属.在现行疫苗中,猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)是最广泛使用的疫苗之一,HCLV是由中国兽药监察所研制成功的猪瘟弱毒疫苗,赠给许多国家后,被适应于许多细胞,国外一律称为C株.     

老虎感染猫传染性鼻-结膜炎病毒的研究

用猫肾传代细胞从发病虎的病料中分到了一株杯状病毒粒子样病毒.该病毒大小为35～39nm、无囊膜、在胞浆中病毒前体呈晶格状排列,抗乙醚、不能被 5-IUDR所抑制,能被来源于标准疫苗的猫传染性鼻-结膜炎病毒(或杯状病毒Feline calicivirus, FCV)抗血清所中和,人工感染猫出现典型的FCV感染症状.RT-PCR能扩增出与设计值相符的电泳带,PC R产物直接测序结果与Genebank发表的FCV序列比较,具有较高的同源性.系统鉴定证明所分离的这株病毒为FCV强毒株,从老虎中分到FCV在世界上尚属首次报道.     

HIV-1 Gag p17-p24在痘苗病毒中的表达及性质研究

研究了重组痘苗病毒表达的HIV1核心蛋白(Gag)p17p24蛋白的一些生物学及免疫学特点。间接免疫荧光、DotELISA及Westernblot结果表明,构建的两株重组病毒分别表达了HIV1Gagp24及p17p24融合蛋白。电镜观察证实,Gagp24及p1724重组蛋白均可形成病毒样粒子。重组病毒可诱导小鼠产生抗HIV1Gagp24抗体。重组病毒感染BHK21细胞后,可见由于细胞凋亡而致的染色体DNA断裂“梯子”电泳图。     

HIV-1 Gag p17-p24在痘苗病毒中的表达及性质研究

研究了重组痘苗病毒表达的HIV-1核心蛋白(Gag)p17-p24蛋白的一些生物学及免疫学特点。间接免疫荧光、Dot ELISA及Western blot结果表明,构建的两株重组病毒分别表达了HIV-1 Gag p24及p17-p24融合蛋白。电镜观察证实,Gag p24及p17-24重组蛋白均可形成病毒样粒子。重组病毒可诱导小鼠产生抗HIV-1 Gag p24抗体。重组病毒感染BHK21细胞后,可见由于细胞凋亡而致的染色体DNA断裂“梯子”电泳图。