新甲型H1N1(2009)流感病毒的早期分子特征

【目的】本世纪首次流感大流行的病原属于甲型H1N1流感病毒,在遗传特性和抗原性等方面都有别于人群中流行多年的季节性H1N1流感病毒。为了深入了解病毒的遗传特性,跟踪病毒的演化趋势,及时发现具有流行病学意义的变异株,本研究对早期分离的甲型H1N1(2009)病毒的分子特性进行了详细分析。【方法】通过GenBank的流感资源中心下载相关毒株的基因组信息,序列分析采用DNAStar软件包的EditSeq和MegAlign,比较与病毒致病性和宿主特异性相关的氨基酸变化情况。以A/California/07/2009(H1N1)作为新甲型H1N1(2009)的早期代表株进行详细的分子特征分析。【结果】A/California/07/2009不具备高致病性流感病毒的分子特征;病毒编码的11个蛋白大部分保留有猪流感病毒的分子特征,同时也具有一些禽和人流感病毒的特征;PB1-F2在11aa,57aa和87aa后发生断裂,具有古典猪H1N1和人H1N1双重特点,这是甲型H1N1(2009)病毒一个特有的分子特征。【结论】首次详细分析了新甲型H1N1(2009)病毒的分子特征。随着病毒在人群中的进一步适应和持续存在,这些分子特征将发生变化,应该特别关注这些变化对病毒的传播力和致病性的影响。     

2009−2015年中国甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

【目的】为了解中国地区2009?2015年甲型H1N1流感病毒流行态势,分析血凝素(Hemagglutinin,HA)基因的变异情况及其遗传进化特征。【方法】汇集国家流感中心2009?2015年流感周报的流感流行数据,分析甲型H1N1流感的流行病学特征;从全球共享禽流感数据倡议组织数据库及美国国家生物技术中心数据库下载甲型H1N1流感病毒HA基因序列,采用生物学软件进行系统进化和遗传特性的分析。【结果】2009?2015年全国共发生4次甲型H1N1流感的流行高峰。2009?2015年毒株与参考毒株A/California/07/2009(H1N1)的HA基因同源性逐年降低。遗传进化分析显示同一年份的毒株在系统进化树上基本呈现集中分布,2011年的毒株独立形成2个分支。分子特征表现为HA基因的4个抗原决定簇氨基酸位点均有变异,其中Ca区的203位、Sa区的163位和Sb区的185位氨基酸位点逐渐替换为新的氨基酸。除2010年与2012年,其他年份的毒株通过不同模型均得到正向压力选择HA氨基酸位点240。【结论】甲型H1N1流感在中国地区成为主要流行的亚型之一。HA基因与其编码的氨基酸逐年变异,未来进一步的流感监测能力还需加强。     

一株2011年出现的季节性甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因特性的研究

本文通过比较2011年分离培养的1株季节性甲型H1N1流行性感冒(简称流感)病毒(A/Shanghai/1167/2011(H1N1))与历年季节性甲型H1N1流感病毒的血凝素(HA)基因,追溯该病毒的基因变异与来源,探讨该毒株的出现对流感防控工作的意义.采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增病毒的HA和神经氨酸酶(NA)片段,并进行测序;应用分子生物学软件对获得的序列进行分析,绘制基因进化树;同时,通过血凝抑制试验检测2011年下半年健康人群中该流感病毒的抗体水平.结果显示,A/Shanghai/1167/2011(H1N1)的HA基因序列与世界卫生组织(WHO)2007～2008年季节性甲型H1N1流感病毒疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)最接近,同源性达99.2%,与新型甲型H1N1流感病毒A/California/07/2009疫苗株同源性仅为72.4%.其HA基因裂解位点为PSIQSR↓GLF,尚未出现高致病性的分子特征.HA片段共编码557个氨基酸,有9个潜在的糖基化位点,序列与2009年前WHO疫苗株A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)、A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)和/Brisbane/59/2007(H1N1)相比,分别有15、12和4处不同,这些差异分布在Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb 5个抗原决定簇的氨基酸差异分别有5、5和2处.该毒株在健康人群血清的抗体阳性率为34.33%,几何平均效价(GMT)为10.38.A/Shanghai/1167/2011(H1N1)是2011年出现在上海地区的一个季节性甲型H1N1流感病毒毒株,其抗原变异与既往季节性甲型H1N1流感病毒相比不大,但在以A(H1N1)pdm09为主要流行株的年份检测到散在发生的既往季节性甲型H1N1流感病毒毒株应当引起重视,其在人群中的抗体水平较低,易引起流行,需要提高对类流感人群中此种毒株的持续监测.     

一株达菲耐药的甲型H1N1流感病毒全基因特征分析

目的分析1株甲型H1N1流感达菲耐药病毒株的全基因特征,为指导流感临床治疗与防控提供依据。方法采用鸡胚进行病毒分离,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增其全基因组8个基因片段,测定核苷酸序列,利用生物信息软件拼接全基因组序列,绘制基因进化树并分析重要基因位点变异情况。结果 A/Fuzhou/SWL11609/2013(H1N1)流感毒株的8个节段基因均处于2013-2014年度进化簇中,且与A/California/07/2009(H1N1)疫苗株高度同源,8个基因同源性均在97.4%以上;其HA和NA基因与A/Hubei-Wuchang/SWL1322/2013(H1N1)达菲耐药株同源性最高,分别为100.0%和99.6%;初步判断该毒株未发生重配现象,其重要致病性基因位点未发生变异;NA基因中具有H275Y典型达菲耐药位点特征,缺失一个糖基化位点(N386K),降低了基因结构的稳定性,同时在V241I和N369K的作用下降低了病毒的适应性。结论本次研究的甲型H1N1流感达菲耐药病毒株表现为低致病性流感病毒特征,但具备较好的人传人能力,需进一步加强监测,谨防耐药株的广泛流行。     

江苏首例甲型H1N1(2009)流感病毒分离及其血凝素分子遗传特征分析

2009年6月12日,江苏确诊首例甲型H1N1(2009)病例。通过细胞和鸡胚分离系统,我们分离到一株具有较高血凝活性的病毒,命名为A/Jiangsu/1/2009。为了跟踪病毒的变异情况,我们开展了病毒的全基因组测序工作,在此基础上对其血凝素基因(Haemagglutinin,HA)的遗传特性进行了详细研究。分离株HA蛋白不具有多碱基HA裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与参考株A/California/04/2009相比,分离株A/Jiangsu/1/2009HA蛋白的有4个氨基酸发生了突变,但都不在已知的抗原位点上。分离株有5个潜在糖基化位点,这与近年来古典猪H1N1和北美三源重配猪H1病毒完全一致,保留了古典猪H1的特点。与禽流感H1病毒相比,分离株HA蛋白受体结合位点上的E190D和G225D发生突变,这可能成为新甲型H1N1(2009)在人际间传播的一个重要分子基础。此外,其它受体结合位点上相关氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。本研究首次对早期流行的甲型H1N1(2009)流感病毒的HA蛋白的分子遗传特征进行了详细研究,对进一步监测病原变异具有重要指导意义。     

上海2009甲型H1N1流行性感冒病毒全基因组分析

2009年全球暴发2009甲型H1N1流行性感冒(简称流感)疫情,上海于2009年5月出现第1例输入型病例。为了解上海地区输入型2009甲型H1N1流感病毒的生物学特征,以上海较早发现的2例输入型甲型H1N1流感患者作为研究对象,分离出A/Shanghai/37T/2009和A/Shanghai/71T/2009病毒,利用实时定量荧光反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定病毒,通过扫描透射电子显微镜观察、免疫荧光检测、全基因组测序和生物信息软件分析,对这2株流感病毒形态、结构、耐药性、基因特点和病毒型别等进行研究。结果显示,病毒呈现正黏病毒颗粒形态特征;犬肾(MDCK)细胞内的病毒能与患者恢复期血清反应。此2株病毒的全基因核酸序列和氨基酸序列与美国参考株A/California/04/2009(H1N1)有较高同源性,其中第31位氨基酸残基发生改变。对金刚烷胺耐药,而对奥司他韦敏感。基于全基因组的系统发育分析,确认此2株病毒属2009甲型H1N1流感病毒。     

A/H1N1流感—世界关注的焦点

2009年4月,A/H1N1流感在墨西哥和美国暴发。随后,疫情迅速蔓延到美洲、欧洲、亚洲多个国家。A/H1N1流感病毒是一种以前在人或动物身上从未观测到的新病毒。遗传进化和抗原特性分析表明该病毒和猪流感病毒密切相关,与人类的季节性流感病毒有明显区别。但是流行病学信息表明A/H1N1流感病毒只攻击人类,并在人与人之间传播,尚未发现动物向人类传播的情况。本文从A/H1N1流感病毒的生物学特性、临床特征、公共卫生意义等方面全面阐述了A/H1N1流感的最新研究进展,为正确认识和科学防控A/H1N1流感提供参考。     

甲型H1N1／2009流感病毒的种属跨越机制

在世界范围流行的甲型H1N1／2009流感病毒具有下述3个重要特征：可寄生于人体,易感人群很多,患者年龄偏低．本研究确定了病毒蛋白中的一块关键区域．该区域对病毒所寄生的物种的种属范围起决定性作用,并且是全球性流感病毒的一个标志性区域．正是该区域氨基酸的特性导致了上述3个特点．具体来说,对宿主的免疫系统而言,病毒蛋白质结构的变化会形成新的标靶结构,并且可以进一步导致宿主范围的变化．基于多肽链发生致病性结构转换的概率,本研究确定了甲型流感病毒中对控制宿主范围起决定性作用的氨基酸的位置．研究发现甲型H1N1／2009流感病毒中处于这些位点的多肽链在本质上可以在寄生于人的毒株中表达,而之前仅在宿主为禽、猪的毒株中被发现．其与另一氨基酸短串的协同构象改变对于甲型H1N1／2009流感病毒的种属跨越具有重要作用．人体对这些关键位点的免疫缺陷导致了甲型H1N1／2009流感病毒宿主人群多和青年人易致病的特点．     

福建省甲型H1N1流感病毒基因特征研究

为了解福建省甲型H1N1流感病毒基因变异特征和规律,对2009~2012年福建省分离的14株甲型H1N1流感病毒进行了全基因序列分析。结果发现,所有的毒株均是典型的低致病性流感病毒,对金刚烷胺类药物耐药,对神经氨酸酶抑制剂敏感。所有毒株与A/California/07/2009(H1N1)疫苗株保持高度同源,8个节段基因同源性均在98.2%以上。相比之下,福建省2012年的流感毒株抗原变异程度较大,其中A/Fujiangulou/SWL1155/2012毒株HA基因发生11个氨基酸位点改变,其中H138R、L161I、S185T和S203T位点的变异分别涉及Ca、Sa和Sb抗原决定簇。监测显示,疫苗对福建省人群保护效果较好,但福建省2012年毒株相对疫苗株已经出现抗原漂移,应进一步密切关注其变异情况。     

21世纪的首次大流行：2009甲型（H1N1）流感

2009年4月初,在墨西哥和美国出现一种新型甲型（H1N1）流感病毒。该病毒通过人-人传播迅速在全球范围蔓延。该病毒拥有来自人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的基因片段,其HA基因与引发1918年大流行的流感病毒株的HA基因同源性很高。该病毒倾向于感染儿童、青少年、孕妇,以及具有心肺疾病的人。据观察,它在人群中的传播能力高于季节性流感。部分感染患者具有在季节性流感中罕见的呕吐和腹泻症状。先前的流感病毒大流行和2009年爆发的甲型H1N1流感病毒大流行表明,由于流感病毒变异速度快、容易发生基因重排,新产生的变异毒株很可能造成新的大流行,威胁人类健康。由于禽流感病毒和人流感病毒都能感染猪,猪被认为是通过基因重排生成新的大流行病毒的＂混合容器＂。     

中国“人-猪-禽”基因重排H1N2亚型猪流感病毒全基因克隆及遗传进化的研究

[目的]为了研究2006年从广西病猪肺组织中分离的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Guangxi/13/2006(H1N2)(Sw/Gx/13/06)的遗传学特性和8个基因的来源.[方法]运用RT PCR方法对其全基因进行了克隆并运用分子生物学软件对其基因序列进行了遗传进化分析.[结果]血凝素(HA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)基因来源于猪古典H1N1亚型流感病毒;神经氨酸酶(NA)和聚合酶蛋白(PB1)基因来源于人的H3N2亚型流感病毒;聚合酶蛋白(PA)和聚合酶蛋白(PB2)基因来自于禽流感病毒.[结论]可见Sw/GX/13/06是一株"人-猪-禽"三源基因重排H1N2亚型SIV且与美国(1999-2001年)和韩国(2002年)分离到该型病毒的有明显的亲缘关系.据我们所知,这是中国首次报道含有禽流感病毒基因片段的重排H1N2 SIV,该病毒是否对养猪业和人类公共卫生健康具有潜在的威胁,有待于进一步研究.     

一株人感染高致病性禽流感(H5N1)病毒基因组分子特征分析

【背景】H5N1禽流感病毒可以感染人类导致重症呼吸道感染,致死率高。【目的】研究我中心确认的一例人感染高致病性禽流感H5N1病毒A/Nanjing/1/2015的可能起源及基因组分子特征。【方法】对病人痰液样本中的H5N1病毒进行全基因组测序,使用CLC Genomics Workbench 9.0对序列进行拼接,使用BLAST和MEGA 5.22软件进行同源性比对和各片段分子特征分析。【结果】该株禽流感病毒属于H5亚型的2.3.2.1c家系,其8个片段均与江浙地区禽类中分离的病毒高度同源,未发现有明显的重配。分子特征显示,该病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点为PQRERRRR/G,受体结合位点呈现禽类受体特点,但出现D94N、S133A和T188I氨基酸置换增强了病毒对人类受体的亲和性。神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白颈部在49-68位缺失20个氨基酸,非结构蛋白1 (Non-structure protein,NS1)存在P42S置换和80-84位氨基酸的缺失。其他蛋白中也存在多个增强病毒致病力和对人类细胞亲和力的氨基酸突变。对耐药位点分析发现存在对奥司他韦的耐药突变H_274Y,病毒对金刚烷胺仍旧敏感。【结论】人感染高致病性禽流感H5N1病毒A/Nanjing/1/2015属于2.3.2.1c家系,禽类来源,关键位点较保守,但仍出现了多个氨基酸的进化与变异使其更利于感染人类。H5N1禽流感病毒进化活跃,持续动态监测不能放松。     

Close relationship between the 2009 H1N1 virus and South Dakota AIV strains

Although previous publications suggest the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus was reassorted from swine viruses of North America and Eurasia, the immediate ancestry still remains elusive due to the big evolutionary distance between the 2009 H1N1 virus and the previously isolated strains. Since the unveiling of the 2009 H1N1 influenza, great deal of interest has been drawn to influenza, consequently a large number of influenza virus sequences have been deposited into the public sequence databases. Blast analysis demonstrated that the recently submitted 2007 South Dakota avian influenza virus strains and other North American avian strains contained genetic segments very closely related to the 2009 H1N1 virus, which suggests these avian influenza viruses are very close relatives of the 2009 H1N1 virus. Phylogenetic analyses also indicate that the 2009 H1N1 viruses are associated with both avian and swine influenza viruses circulating in North America. Since the migrating wild birds are preferable to pigs as the carrier to spread the influenza viruses across vast distances, it is very likely that birds played an important role in the inter-continental evolution of the 2009 H1N1 virus. It is essential to understand the evolutionary route of the emerging influenza virus in order to find a way to prevent further emerging cases. This study suggests the close relationship between 2009 pandemic virus and the North America avian viruses and underscores enhanced surveillance of influenza in birds for understanding the evolution of the 2009 pandemic influenza.     

禽流感H5N1病毒感染BALB/c小鼠的细胞免疫动态变化

[目的]测定H5N1病毒感染BALB/c的小鼠模型的细胞免疫动态变化,探讨病毒对机体免疫系统的影响。[方法]通过流式细胞仪测定CD3+T、CD4+T、CD8+T等细胞免疫变化。[结果]感染H5N1病毒的小鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞数量下降(P<0.05),脾脏中T细胞数量下降的趋势与血液相同,CD4+T/CD8+T的比例上升,只是两者的时间有所差别。[结论]说明病毒对细胞免疫T细胞数量影响较大,而且CD8+T受到的影响更为明显,反应了机体特异性细胞免疫功能受抑制,并且彼此之间的平衡受到破坏。     

Isolation and genetic characterization of avian-like H1N1 and novel ressortant H1N2 influenza viruses from pigs in China

As pigs are susceptible to both human and avian influenza viruses, they have been proposed to be intermediate hosts or mixing vessels for the generation of pandemic influenza viruses through reassortment or adaptation to the mammalian host. In this study, we reported avian-like H1N1 and novel ressortant H1N2 influenza viruses from pigs in China. Homology and phylogenetic analyses showed that the H1N1 virus (A/swine/Zhejiang/1/07) was closely to avian-like H1N1 viruses and seemed to be derived from the European swine H1N1 viruses, which was for the first time reported in China; and the two H1N2 viruses (A/swine/Shanghai/1/07 and A/swine/Guangxi/13/06) were novel ressortant H1N2 influenza viruses containing genes from the classical swine (HA, NP, M and NS), human (NA and PB1) and avian (PB2 and PA) lineages, which indicted that the reassortment among human, avian, and swine influenza viruses had taken place in pigs in China and resulted in the generation of new viruses. The isolation of avian-like H1N1 influenza virus originated from the European swine H1N1 viruses, especially the emergence of two novel ressortant H1N2 influenza viruses provides further evidence that pigs serve as intermediate hosts or “mixing vessels”, and swine influenza virus surveillance in China should be given a high priority.     

长沙A(H1N1)亚型季节性流感暴发疫情的实验室诊断及其HA基因特性分析

对2009 年长沙麓山国际学校流感暴发疫情进行实验室诊断, 并探索新分离的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素(HA)的基因特性。对流感暴发疫情的25 份鼻/咽拭子标本进行RT-PCR检测和流感病毒分离, 然后利用CEQ?8000 Genetic Analysis System对病毒分离株(A/Yuelu/314/2009)进行测序, 测序结果提交至GenBank(登录号: FJ912843)并用ClustalX和Mega4.1软件进行序列分析。结果显示, 分离出A(H1N1)亚型流感毒株18株, 检出21份A(H1N1)亚型流感病毒核酸阳性; A/Yuelu/314/2009(H1N1) HA基因序列与2008~2009 年疫苗株(A/Brisbane/59/2007)比较显示: 核苷酸和氨基酸同源性均为99%, 有6个位点的氨基酸发生了变异(V148A、S158N、G202A、I203D、A206T、W435R), 其中一个S158N氨基酸变异位于B抗原表位, HA基因序列上共有潜在糖基化位点9 个(27、28、40、71、151、176、303、497、536), 与A/Brisbane/59/2007相同且氨基酸序列保守。本实验诊断出此次流感暴发疫情的病原体为A(H1N1)型季节性流感病毒, 研究还发现A/Yuelu/314/2009(H1N1)长沙分离株与A/Brisbane/59/2007 疫苗株基因序列比较显示并未形成一个新的变种, 推测是由于分离株与疫苗株之间基因特性的改变和人群对A(H1N1)亚型流感病毒免疫力降低导致了此次长沙麓山国际学校A(H1N1)亚型流感的暴发。     

1968−2014年中国甲型H3N2流感病毒PB1基因进化分析

【目的】分析季节性H3N2流感病毒PB1基因序列的变异情况,揭示H3N2流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势。【方法】对1968?2014年中国地区82株人H3N2毒株、2012?2014年江苏省分离的81株甲型H3N2流感病毒、6株SIV和4株AIV H3N2亚型PB1、PB1-F2基因进行分子进化分析。【结果】1968?2014年中国H3N2流感毒株PB1核苷酸和氨基酸相似性分别为90.91%?100%和96.91%?100%。系统进化树分析,1968?2014年共173株H3N2流感病毒总体上分为4个分支,2002?2014年分离毒株位于第IV分支上,1968?1994年分离毒株位于第II和III分支;猪源H3N2亚型分布于第I、II、IV分支上;分子特征显示PB1氨基酸52、113、179、216、576、586、619、621、709位在2002年以后发生适应性改变,替换了原来的氨基酸;PB1-F2基因编码截断型蛋白长度有52、34、25、24、11 aa (猪源),PB1-F2蛋白毒力关键位点上未出现高致病性特征突变。【结论】自1968年起H3N2亚型PB1基因变异逐步趋于稳定,且PB1-F2截断型毒株正逐渐成为一类新的进化特征,但PB1基因与其他亚型之间发生重配以及关键毒力位点的变异仍应是监测的重点。     

应用焦磷酸测序技术快速检测猪流感病毒金刚烷胺耐药性的分子标签

【目的】本研究旨在通过焦磷酸测序技术对我国分离的H1N1、H3N2、H9N2等3种基因型的10株猪流感病毒分离株进行金刚烷胺耐药性鉴定。【方法】流感病毒M2蛋白5个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对2004-2008年国内分离的10株猪流感病毒M基因金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。【结果】基于M2蛋白基因保守区序列建立的焦磷酸测序技术能用于国内猪流感病毒的快速检测,且具有较好的特异性和重复性。抗药性分析表明10株猪流感病毒国内分离株中5株H1N1分离株全部耐药,主要存在M2蛋白的V27T、V27I或S31N位点的突变,而4株H3N2和1株H9N2猪流感病毒分离株在M2蛋白5个关键位点上均未出现变异,表明其对金刚烷胺敏感。【结论】基于M基因的焦磷酸测序技术可以用于我国猪流感病毒金刚烷胺耐药性快速鉴定。     

Diagnosis of influenza viruses with special reference to novel H1N1 2009 influenza virus

On 15 April and 17 April 2009, novel swineorigin influenza A (H1N1) virus was identifi ed in specimens obtained from two epidemiologically unlinked patients in the United States. The ongoing outbreak of novel H1N1 2009 influenza (swine influenza) has caused more than 3,99,232 laboratory confi rmed cases of pandemic influenza H1N1 and over 4735 deaths globally. This novel 2009 influenza virus designated as H1N1 A/swine/California/04/2009 virus is not zoonotic swine flu and is transmitted from person to person and has higher transmissibility then that of seasonal influenza viruses. In India the novel H1N1 virus infection has been reported from all over the country. A total of 68,919 samples from clinically suspected persons have been tested for influenza A H1N1 across the country and 13,330 (18.9%) of them have been found positive with 427 deaths. At the All India Institute of Medical Sciences, New Delhi India, we tested 1096 clinical samples for the presence of novel H1N1 influenza virus and seasonal influenza viruses. Of these 1096 samples, 194 samples (17.7%) were positive for novel H1N1 influenza virus and 197 samples (18%) were positive for seasonal influenza viruses. During outbreaks of emerging infectious diseases accurate and rapid diagnosis is critical for minimizing further spread through timely implementation of appropriate vaccines and antiviral treatment. Since the symptoms of novel H1N1 influenza infection are not specifi c, laboratory confi rmation of suspected cases is of prime importance.