一种快速鉴定猪肺炎支原体免疫显性蛋白抗原的ELISA方法的建立

旨在建立一种快速鉴定猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)血清体液免疫显性蛋白抗原的方法。通过构建p GEX-6P-1-mhp366重组表达质粒并转入大肠杆菌BL21(DE3),将GST-Mhp366重组蛋白进行原核表达。将GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液加入谷胱甘肽包被板进行抗原包被,分别与17份Mhp阳性血清和13份Mhp阴性血清反应,通过对抗原包被量、封闭液、血清和二抗稀释度的优化,确定间接ELISA的反应条件。最终确定GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液原液为抗原的最佳包被量,PBS+10%FBS+2.5%脱脂奶粉为最佳封闭液,分别将血清按照1∶500稀释、酶标二抗按照1∶40 000稀释作为最佳工作浓度,从而建立了一种基于间接ELISA的快速鉴定Mhp血清体液免疫显性蛋白抗原的方法,同时通过已知的血清体液免疫显性蛋白Mhp156和Mhp364对所建立的方法进行了验证。该方法的建立能够用于在基因组水平高通量筛选Mhp血清体液免疫显性蛋白抗原,并为Mhp初乳体液免疫和黏膜免疫显性蛋白抗原鉴定方法的建立奠定基础。     

猪肺炎支原体Mhp367蛋白不同区段与恢复期血清反应能力的比较

【背景】课题组前期研究发现猪肺炎支原体Mhp367蛋白是体液免疫显性蛋白,但该蛋白不同区段与猪肺炎支原体恢复期血清的反应能力尚不明确。【目的】鉴定Mhp367蛋白不同区段与猪肺炎支原体恢复期血清的反应能力。【方法】利用不同的引物组合扩增mhp367基因片段,扩增的片段连接pGEX-6P-1、pGEX-4T-3或pGEX-5X-3载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取的质粒经Bam H I和Xho I双酶切及测序确定重组质粒是否构建成功。正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞构建重组菌。重组菌经IPTG诱导和超声破菌后,经与谷胱甘肽beads结合和SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达情况。表达目的蛋白的重组菌破菌后上清包被谷胱甘肽板,ELISA方法鉴定Mhp367蛋白不同区段与猪肺炎支原体恢复期血清的反应能力。【结果】构建了9个能以可溶形式表达目的蛋白的重组菌;9个Mhp367蛋白片段均为体液免疫显性,第394-524位氨基酸区段与猪肺炎支原体恢复期血清反应最强,是一个良好的疫苗候选抗原区段。【结论】本研究为猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗的研发提供了候选抗原靶标。     

兔抗肠道病毒71型截短VP1抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗肠道病毒71型(EV71)截短VP1多克隆抗体,为EV71基础研究奠定基础。方法 RT-PCR扩增EV71VP1-N160基因(480 bp),以p GEX-6p-1为表达载体,构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-VP1-N160融合蛋白,并对其进行纯化。以纯化的GST-VP1-N160融合蛋白作为免疫原,经背部皮下免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,ELISA检测多克隆抗体效价,间接免疫荧光法和免疫印迹检测抗体特异性。结果经双酶切鉴定,表明重组表达质粒p GEX-6p-1-VP1-N160构建正确;GST-VP1-N160融合蛋白相对分子质量为35 000~55 000,主要为不可溶性包涵体形式,其在大肠杆菌中高效表达;纯化后目的蛋白纯度约为95%,蛋白质量浓度1.9 mg/m L;免疫家兔后,免疫血清效价可达1012,抗VP1-N160多克隆抗体可以识别EV71原核表达的重组蛋白及天然病毒抗原中的VP1,特异性好。结论成功制备了抗EV71截短VP1多克隆抗体。     

单增李斯特菌InternalinA的表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆表达单增李斯特菌膜表面蛋白InternalinA(InlA),经免疫家兔获得多克隆抗体,为建立其免疫磁珠富集快速检测方法奠定基础。【方法】利用生物软件设计单增李斯特菌inlA基因的引物,通过PCR扩增出inlA基因,并将其克隆至pET28a()原核表达载体,转化大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。免疫家兔,制备其多克隆抗体。间接ELISA检测多抗的效价及交叉性,免疫荧光分析多抗与单增李斯特菌菌体结合的特异性。【结果】成功表达了InlA蛋白,融合表达产物分子量约为92 kD,质谱鉴定其为InlA蛋白;免疫家兔获得的抗血清效价为1:100 000,除与金黄色葡萄球菌约20%的交叉外,与副溶血弧菌等其它病源菌均无交叉;免疫荧光证实该多抗特异性结合于单增李斯特菌膜表面,与同种属的威尔斯李斯特菌不结合。【结论】成功制备了单增李斯特菌特异性的兔多克隆抗体,为单增李斯特菌免疫磁珠富集快速检测方法的建立奠定了基础。     

猪肺炎支原体p97 C末端基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

摘要：【目的】构建携猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）黏附因子p97 C末端基因的重组腺病毒并研究其诱导小鼠产生的免疫反应,为研制新型Mhp疫苗奠定基础。【方法】从Mhp基因组中扩增p97 C末端基因,并将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,该重组穿梭质粒经Pme I线性化后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组获得重组腺病毒DNA,纯化后的重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后转染AD293细胞以获得重组腺病毒。对该重组腺病毒进行RT-PCR、间接     

果蝇凋亡蛋白Strica的原核表达、多克隆抗体的制备及在放线菌酮诱导下的激活状态检测

【目的】细胞凋亡是真核生物中保守的细胞程序化死亡,由蛋白酶caspase介导。Strica是果蝇Drosophila中一个特殊的caspase,至今未有其商品化抗体且生化功能未知。本研究旨在通过克隆、原核表达纯化果蝇Strica蛋白并制备其多克隆抗体来初步研究其功能。【方法】根据果蝇Strica的基因序列构建原核表达载体并转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞,表达Strica蛋白;将表达纯化后的Strica蛋白免疫家兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA和Western blot分别测定抗体效价和灵敏度;利用前期构建的过表达载体pAc5-V5-Strica进行转染果蝇S2细胞,设计合成siRNA进行RNAi验证该抗体的特异性;利用该抗体通过免疫荧光实验检测Strica在果蝇S2细胞中的亚细胞定位;利用该抗体通过Western blot实验探究放线菌酮(10 μg/mL)处理后果蝇S2细胞中Strica蛋白的激活状态。【结果】获得了果蝇Strica重组蛋白;ELISA检测Strica抗体的效价大于1∶25 600;Western blot鉴定该抗体在1∶10 000的稀释度下能与重组蛋白反应;该抗体可以检测到S2细胞中过表达以及内源性Strica蛋白;Strica蛋白在S2细胞质中呈现散点分布;放线菌酮介导Strica蛋白的切割激活。【结论】成功制备了兔抗果蝇Strica多克隆抗体。Strica响应凋亡刺激物放线菌酮激活,推测Strica参与果蝇的细胞凋亡过程。本研究为进一步深入研究Strica的功能奠定了实验基础。     

人细小病毒B19 VP1u多克隆抗体的制备及其保守区外N端氨基酸对sPLA2活性影响的初步研究

【目的】制备人细小病毒B19-VP1u的多克隆抗体,探究VP1u多克隆抗体及其保守区外N端氨基酸对病毒磷脂酶A2活性的影响。【方法】首先通过分子克隆方法构建相应原核表达载体;利用原核表达系统纯化含MBP标签的VP1u全长及N端系列截短突变融合蛋白;接着免疫新西兰大白兔制备全长VP1u蛋白的多克隆抗体;最后利用磷脂酶A2活性检测试剂盒检测了纯化蛋白的磷脂酶A2活性。【结果】Western blot及免疫荧光实验证实制备的多克隆抗体具有较高的特异性;磷脂酶A2活性检测发现全长VP1u-MBP融合蛋白具有一定的活性,该活性可以被VP1u的抗体抑制;N端保守区外截短系列蛋白的酶活检测发现,N端截掉12个氨基酸时酶活降低53%,截掉67个氨基酸时酶活性几乎完全丧失。【结论】首次发现VP1u保守区外N端氨基酸,尤其是第12个氨基酸前的区域以及第22-67个氨基酸之间的区域,对sPLA2活性的保持具有重要意义,推测该区域可能对维持正常的蛋白构象起重要的作用;而其特异性多克隆抗体的制备也为进一步研究B19病毒VP1u在病毒复制周期的作用奠定基础。     

1株猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定

【背景】猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,主要引起以急性水样腹泻、呕吐和脱水等特征的胃肠道疾病。在PDCo V的4个结构蛋白中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)为高度保守的结构蛋白,在病原诊断方面具有重要意义。【目的】以纯化的重组PDCo VN蛋白为抗原,制备抗N蛋白的单克隆抗体并进行特性鉴定。【方法】利用已构建的p ET-28a-N表达菌,经IPTG诱导表达获得具有免疫原性的重组N蛋白,并将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,经3次亚克隆筛选,选取抗体效价最高的一株杂交瘤细胞注射小鼠腹腔并制备腹水单克隆抗体,利用Protein G亲和层析柱纯化。通过腹水单克隆抗体效价测定、抗体亚型鉴定、Western blot鉴定其特性;利用细胞间接免疫荧光试验、组织石蜡切片荧光试验、免疫组化、流式细胞荧光分选技术鉴定其诊断应用价值。【结果】经筛选后得到一株杂交瘤细胞命名为4E88,其腹水单克隆抗体效价为1:105,亚型为Ig G1型,轻链为κ链,Western blot试验表明该单克隆抗体与重组N蛋白和超速离心纯化的PDCo V全病毒反应形成特异性条带。此外,单克隆抗体4E88可以用于猪δ冠状病毒检测的间接免疫荧光试验、免疫组化染色和流式细胞荧光分选技术。【结论】研究获得的单克隆抗体4E88具有较好的反应性,为后续开展PDCo V鉴定、诊断和N蛋白功能研究等奠定基础。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP53B原核表达及抗血清的制备

【目的】研究对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白sVP53B克隆、表达、纯化及抗血清制备。【方法】根据WSSV囊膜蛋白基因序列,设计引物,PCR扩增出功能序列(Svp53B),构建到pET-16b载体后,转化至大肠杆菌Rosetta 2诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting检测优化表达。表达产物采用Ni-NTA琼脂糖磁珠进行纯化、割胶回收融合蛋白,以纯化的Svp53B-his为抗原,免疫兔子获得多克隆抗体,通过间接ELISA检测抗体的效价。【结果】构建重组质粒pET-16b-Svp53B,在大肠杆菌Rosetta 2中以1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,主要以包涵体形式表达。纯化包涵体蛋白免疫兔子,获得多克隆血清,效价达到1:150 000。【结论】原核表达并纯化得到高纯度的WSSV囊膜蛋白sVP53B,制备的兔源多克隆血清亲和力高、特异性好,这对后期进一步研究VP53B与经口侵染相关功能奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S2截短肽的原核表达及其线性B细胞表位区鉴定

【背景】由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV S蛋白可以诱导宿主产生中和抗体。【目的】原核表达PEDV CV777疫苗株S2截短肽(aa:961-1 382)并制备其多克隆抗体;鉴定表达的S2截短肽上的线性B细胞表位区。【方法】将经密码子优化的PEDV S2截短肽编码DNA (s2t)克隆至载体p ET-28a中并转化Escherichia coli BL21(DE3),利用IPTG诱导S2截短肽表达。以经SDS-PAGE切胶纯化的重组S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。在E. coli BL21中GST融合表达覆盖S2截短肽序列全长、彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S2截短肽兔血清为一抗,通过Westernblot(WB)筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S2截短肽上的线性B细胞表位区。【结果】重组PEDV S2截短肽的相对分子质量约为50 kD;诱导4 h表达量最高,且主要形成包涵体。WB结果显示,纯化的S2截短肽能被猪抗PEDV血清识别;以纯化的S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多抗血清,ELISA法检测抗体效价位于1:25 600-1:102 400之间。免疫组化和间接免疫荧光分析均表明,制备的多抗血清可以识别Vero细胞培养的PEDV DR13弱毒株。以制备的多抗血清通过WB从52个GST融合表达的16肽中鉴定到11个阳性反应性16肽。WB分析显示,得到的阳性反应性16肽都可以被猪抗PEDV血清识别。鉴定到的阳性16肽在S2截短肽上形成4个线性B细胞表位区(aa:969-984;1 065-1 096;1 225-1 280;1 361-1 382)。【结论】高效价抗PEDV S2截短肽多克隆抗体的制备和S2截短肽上线性B细胞抗原表位区的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立有效的PEDV检测方法奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌六型分泌系统效应蛋白Clpv对巨噬细胞极化的影响北大核心

【目的】探讨Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)效应蛋白Clpv在鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)致病过程中的功能。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344基因组为模板克隆clpv基因,并比较与其他革兰氏阴性菌台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)、植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)、鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)、菠萝多源菌(Pantoea ananatis)、粘放线菌(Actinomyces viscosus)和大肠埃希菌(Escherichia coli)的同源性;将clpv基因克隆至pEGFP-N1载体构建重组质粒pEGFP-Clpv,利用Western blotting、实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)、荧光显微镜以及流式细胞术检测蛋白表达、定位及诱导小鼠巨噬细胞M1型和M2型极化水平。【结果】clpv基因全长为2637 bp,与台湾假单胞菌的同源性最高;Western blotting、qPCR和免疫荧光检测表明重组蛋白大小约120 kDa,在细胞中有明显绿色荧光并且主要定位于细胞膜;q-PCR和流式细胞术结果发现Clpv转染组巨噬细胞M1型极化显著增加(P<0.01),M2型巨噬细胞极化显著减少(P<0.01)。【结论】成功克隆表达鼠伤寒沙门菌T6SS效应蛋白Clpv,并明确其胞内表达定位以及对巨噬细胞极化的影响。     

Transcription Analysis of the Porcine Alveolar Macrophage Response to Mycoplasma hyopneumoniae

Mycoplasma hyopneumoniae is considered the major causative agent of porcine respiratory disease complex, occurs worldwide and causes major economic losses to the pig industry. To gain more insights into the pathogenesis of this organism, the high throughput cDNA microarray assays were employed to evaluate host responses of porcine alveolar macrophages to M. hyopneumoniae infection. A total of 1033 and 1235 differentially expressed genes were identified in porcine alveolar macrophages in responses to exposure to M. hyopneumoniae at 6 and 15 hours post infection, respectively. The differentially expressed genes were involved in many vital functional classes, including inflammatory response, immune response, apoptosis, cell adhesion, defense response, signal transduction, protein folding, protein ubiquitination and so on. The pathway analysis demonstrated that the most significant pathways were the chemokine signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, RIG-I-like receptor signaling pathway, nucleotide-binding oligomerization domains (Nod)-like receptor signaling pathway and apoptosis signaling pathway. The reliability of the data obtained from the microarray was verified by performing quantitative real-time PCR. The expression kinetics of chemokines was further analyzed. The present study is the first to document the response of porcine alveolar macrophages to M. hyopneumoniae infection. The data further developed our understanding of the molecular pathogenesis of M. hyopneumoniae.     

硫氧还蛋白Lmo1903介导单增李斯特菌抵抗氧化应激的生物学功能研究

【目的】以单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)硫氧还蛋白Lmo1903为研究对象,研究其在细菌环境适应过程中的抗氧化应激生物学作用。【方法】使用生物信息学方法分析Lmo1903的进化关系和关键活性位点,使用酶切连接的方法构建Lmo1903蛋白表达载体,获得纯化的重组蛋白,以胰岛素为底物分析其氧化还原酶学活性;同时制备鼠源多克隆抗体,分析其在细胞内的定位;采用核苷酸定点突变技术构建CX1X2C基序中的半胱氨酸点突变蛋白,分析关键位点半胱氨酸对Lmo1903酶活的影响;采用同源重组原理构建lmo1903基因缺失株Δlmo1903和回补株CΔlmo1903,研究lmo1903在单增李斯特菌生长、运动和抗氧化应激方面发挥的功能。【结果】生物信息学分析显示,Lmo1903含有CX1X2C基序,与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的TrxA的亲缘关系较近,属于硫氧还蛋白家族成员,主要定位在细菌细胞质中,具有较强的还原酶学活性,突变CX1X2C基序中的半胱氨酸残基会显著降低Lmo1903的还原酶活能力。缺失lmo1903不影响单增李斯特菌的生长能力,但显...     

表达GFP/mCherry白色念珠菌的构建及其在与巨噬细胞互作中的应用

白色念珠菌(Candida albicans)被巨噬细胞吞噬的效率与被吞噬后的形态观察是研究白色念珠菌与巨噬细胞互作的重要内容。【目的】以野生型菌株SC5314为母本,构建能够表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)/mCherry的白色念珠菌,应用于巨噬细胞与白色念珠菌互作的研究。【方法】通过生长与形态观察、细胞活性检测及小鼠系统性感染模型确定荧光蛋白的表达对菌株生长、形态与毒力的影响;在共培养条件下,通过流式细胞术及荧光显微镜检测巨噬细胞的吞噬率及白色念珠菌的形态变化。【结果】构建的菌株在表型上与野生型菌株一致,并可用于在共培养下测定巨噬细胞吞噬率的流式细胞术以及观察白色念珠菌的形态变化。【结论】表达荧光蛋白的菌株为研究巨噬细胞与白色念珠菌的互作提供了新方法。     

鰤诺卡氏菌对大口黑鲈头肾巨噬细胞的侵染过程

【背景】鱼类诺卡氏菌病潜伏期和病程较长,感染率和死亡率较高,给水产养殖业带来较大的经济损失,其病原鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是胞内寄生菌,侵入细胞后引起慢性感染是主要的致病机制。【目的】构建鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈(Micropterus salmoides)头肾巨噬细胞体外模型,观察鰤诺卡氏菌侵染巨噬细胞的过程并探究鰤诺卡氏菌对巨噬细胞的凋亡作用。【方法】采用密度梯度离心法分离巨噬细胞,通过特异性染色和PCR扩增巨噬细胞表达基因mpeg1对细胞进行鉴定,并通过CCK-8法和氧呼吸暴发活性测定检测巨噬细胞的活性;通过倒置荧光显微镜和流式细胞术观察侵染过程中细菌与细胞的形态与数量变化;通过双荧光流式细胞术检测、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放试验及线粒体膜电位检测,探究鰤诺卡氏菌对巨噬细胞的凋亡作用。【结果】从大口黑鲈头肾分离获得纯度高的巨噬细胞,经染色和PCR法鉴定为巨噬细胞;筛选出最优的体外培养条件为1640培养基+1%青霉素链霉素+1%胎牛血清。在脂多糖刺激后,巨噬细胞的氧呼吸暴发能力显著提高(P<0.05)。GFP-鰤诺卡氏菌侵染细胞2 h后细菌被细胞吞噬,4 h细胞变圆且贴壁率降低,6 h细菌大量繁殖并包围细胞,8 h后细胞大量死亡。凋亡相关实验结果表明,侵染初期巨噬细胞凋亡率增加,LDH释放增加,线粒体膜电位下降;随着侵染时间延长,细胞凋亡率下降、LDH释放量及线粒体膜电位下降减少,说明鰤诺卡氏菌对巨噬细胞起先促进后抑制凋亡的作用。【结论】通过密度梯度离心法成功分离大口黑鲈头肾巨噬细胞,并通过鰤诺卡氏菌侵染细胞后初步摸清鰤诺卡细菌在细胞水平的致病机理,建立了鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈头肾巨噬细胞的体外模型;证实了鰤诺卡氏菌可侵染巨噬细胞并抑制细胞凋亡,从而达到在巨噬细胞内存活,为进一步开展鰤诺卡氏菌与巨噬细胞相互作用并阐明鰤诺卡氏菌的致病机制奠定了研究基础。     

结核分枝杆菌PE＿PGRS15调控分枝杆菌细胞包膜结构与耐药性

【目的】研究结核分枝杆菌PE＿PGRS15的功能。【方法】构建过表达PE＿PGRS15蛋白的重组耻垢分枝菌酸杆形菌，通过细胞分级分离实验检测其细胞定位。通过涂布实验、扫描电镜和透射电镜观察细菌菌落形态、细菌表面形态及细胞包膜(cell envelope)结构。通过杀菌曲线法及微量肉汤稀释法检测重组菌对环境压力及抗生素的耐受性。通过染料摄取实验检测重组菌细胞壁通透性，并用气相色谱-质谱联用仪检测重组菌细胞壁脂肪酸谱。通过蛋白截短及融合实验分析PE＿PGRS15蛋白结构域的功能。【结果】PE＿PGRS15蛋白定位于重组菌细胞壁，其表达影响重组菌菌落形态和细胞包膜结构，增强重组菌对环境压力和抗生素的耐受。PE＿PGRS15的表达导致重组菌细胞包膜脂肪酸含量增加，也降低了重组菌的细胞壁通透性。PE＿PGRS15蛋白的PE结构域负责将该蛋白转运到细胞表面，而PGRS结构域介导重组菌对压力条件和抗生素的耐受。【结论】PE＿PGRS15蛋白可能通过调控耻垢分枝菌酸杆形菌细胞包膜的结构进而影响细菌菌落形态、细胞壁通透性及耐药性，为解析PE/PPE家族蛋白的功能奠定了一定的基础。     

小檗碱抗新生隐球菌活性和作用机制

【目的】研究小檗碱对新生隐球菌的抗菌活性及其作用机制。【方法】采用微量肉汤稀释法测定小檗碱对新生隐球菌标准菌株和临床分离菌株的最小抑菌浓度,通过棋盘法测定小檗碱与氟康唑、两性霉素B的协同作用,测定小檗碱对隐球菌重要毒力因子的表达,以及对巨噬细胞和隐球菌互作的影响,采用隐球菌感染大蜡螟模型测定小檗碱的体内杀菌活性。【结果】小檗碱是一种杀真菌化合物,在测试的菌株中,最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)范围为8-16μg/mL。亚致死剂量小檗碱能够抑制隐球菌荚膜大小、产黑色素能力和有性生殖能力,并能增强巨噬细胞的杀菌能力。锌指转录因子Nrg1介导了上述重要的过程。在隐球菌感染动物模型中,小檗碱能够延长感染大蜡螟的存活时间。【结论】小檗碱在体内外具有优异的抗隐球菌活性,有望作为抗隐球菌药物开发的起始化合物。     

寡雄腐霉发酵液的动物安全性及其对黄瓜的防病促生效应

【目的】生物农药安全无害,环境友好。为了评价寡雄腐霉发酵液(Pythium oligandrum broth,POB)的动物安全性和防病促生效应,研制高效、无害的生物农药。【方法】试验利用自主分离的寡雄腐霉生防菌株(P.oligandrum CQ2010)制备POB,通过动物试验、拮抗试验、盆栽和生产试验,研究了POB的动物毒性,对黄瓜蔓枯病的防治作用,以及对黄瓜生长、产量和品质的影响。【结果】用大剂量的POB灌胃给药对小鼠体重增长无显著影响,其外观和行为均无异常,组织器官也未见病理改变。POB对甜瓜球腔菌的抑制率为51.95%,药效介于1∶800的百菌清溶液和1∶200的甲基托布津溶液之间。在黄瓜幼苗接种甜瓜球腔菌前后喷施POB,叶片丙二醛含量下降,过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增强,发病率和病情指数均显著降低,相对防治效果达到54.8%–64.1%,故POB能减轻病原菌对细胞膜的伤害,激发防御性生理反应,增强黄瓜植株的抗病能力。此外,POB处理提高叶绿素含量,增强根系活力,增加植株氮、磷、钾吸收量,促进黄瓜植株生长,生物量和果实产量分别提高81.10%和11.58%。POB还使黄瓜果实Vc和可溶性糖提高,硝酸盐含量降低。【结论】寡雄腐霉发酵液对动物安全无毒,能有效防治黄瓜蔓枯病,促进黄瓜生长,提高产量品质。