家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性分布

家蚕Bombyx mori的胰凝乳蛋白酶抑制剂（chymotrypsin inhibitor,CI）在家蚕发育过程中发挥着重要作用,具有丰富的多态性。为了进一步研究家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂在群体水平上的多态性分布,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,调查了425个家蚕品系的血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的分布情况。结果表明,基因Ict-A、Ict-D和Ict-E在所有家蚕品系中存在,暗示它们是家蚕正常生长发育必需的基因; 相反,至少在9个家蚕品系中发现基因Ict-B和Ict-H都没有表达,而这些品系没有明显的生理缺陷。在中国品系和日本品系家蚕之间,胰凝乳蛋白酶抑制剂分布规律基本一致。对52个纯品系家蚕的胰凝乳蛋白酶抑制剂分布进行的聚类分析结果表明,胰凝乳蛋白酶抑制剂分布与其系统、眠性和化性都没有明显的相关性。所以家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂广泛存在于不同家蚕品系中,同时多态性的分布特征也表明其生理功能在进化过程中发生了明显的分化。     

南美斑潜蝇为害对黄瓜叶片中蛋白酶抑制剂活性及葫芦素B含量的影响

【目的】蛋白酶抑制剂和葫芦素是两类在植物中具有抗虫活性的化合物,在植食性昆虫与其寄主植物相互作用中起着重要的作用。本文在室内研究了南美斑潜蝇Liriomyza huidobrensis(Blanchard)为害对黄瓜叶片中蛋白酶抑制剂活性及葫芦素B含量的影响,以期揭示南美斑潜蝇与其寄主植物相互作用的机理以及为利用诱导抗性控制南美斑潜蝇的为害奠定必要的基础。【方法】用分光光度法和高效液相色谱法,分别测定了南美斑潜蝇幼虫为害后黄瓜叶片中蛋白酶抑制剂活性和葫芦素B含量的变化。【结果】在南美斑潜蝇幼虫为害期间(1~9 d),黄瓜叶片中胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂活性及葫芦素B含量与健康对照相比显著上升,但上升幅度并不与为害强度和为害持续时间相一致,其中对胰蛋白酶抑制剂具有系统诱导作用,而对胰凝乳蛋白酶抑制剂和葫芦素B的系统诱导作用不明显。【结论】南美斑潜蝇幼虫为害可诱导寄主植物体内蛋白酶抑制剂活性和葫芦素B含量上升,培育蛋白酶抑制剂或葫芦素含量高或易诱导的黄瓜品种可能是控制南美斑潜蝇为害的有效途径。     

三种鳞翅目幼虫肠道蛋白水解酶的活性

本工作以酪蛋白为底物,测定粘虫Mythimna separata Walker、棉铃虫Heliothis armigera Hubner和大蜡螟 Galleria mellonlla Linnaeus三种鳞翅目幼虫肠道蛋白水解酶的活性,并分别用BTEE和TAME为底物,测定了其中类胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶的活性.结果表明:三种幼虫肠道都含有类胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶.抑制剂TPCK可以部分地抑制类胰凝乳蛋白酶的活性,而胰酶抑制剂则显著地抑制类胰蛋白酶的活性.     

朱砂叶螨刺吸胁迫对玉米自交系化学防御物质的系统诱导效应

为了探明朱砂叶螨刺吸胁迫对玉米体内化学防御的系统诱导效应,以玉米抗螨性自交系‘H1014168’和感螨性自交系‘H1014591’幼苗为材料,在叶螨刺吸第1叶7 d后,测定了未被刺吸部位(第2叶和根系内)的丁布、总酚、胰蛋白酶抑制剂(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)含量.结果表明: H1014168 第2叶和根内的丁布、总酚、TI和CI含量均显著高于健康植株; H1014591 第2叶内4种化学防御物质含量显著高于健康植株,根内TI含量显著高于健康植株,丁布和CI含量与健康植株差异不显著,总酚含量显著低于健康植株.朱砂叶螨刺吸胁迫对玉米体内的丁布、总酚、胰蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂的诱导具有系统性,对玉米抗螨性自交系的系统诱导效应强于感螨性自交系.     

绿僵菌分解昆虫外壳蛋白酶MAP-21的纯化与特性

以蝉蜕为底物诱导绿僵菌产生分解昆虫外壳蛋白酶 。发酵液经超滤、Ultrogel AcA 54凝胶层析、制备IEF电泳,纯化了一种蛋白酶MAP-21,SDS-PAGE电泳后经银染色呈单带。该酶的Mr为27kD左右,pI为76。它的特异识别氨基酸为Arg,其活性可被PMSF和TLCK抑制,表明其活性中心有Ser和His残基。它还可被胰蛋白酶的典型抑制剂Leupeptin、Antipain及STI等所抑制,而胰凝乳蛋白酶抑制剂TPCK和胰凝乳弹性蛋白酶抑制剂TEI对其活性无影响。专一底物和抑制剂特性试验结果表明MAP-21是类胰蛋白酶。此外,该酶还可被EDTA所抑制,表明金属离子为其活性所必需。另外还研究了MAP-21的最适作用温度和pH,以及温度耐受性等特性。     

马铃薯蛋白酶抑制因子特性的研究

本文研究了马铃薯蛋白酶抑制因子的稳定性及其对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白梅的抑制能力,结果表明：该抑制因子对胰蛋白酶活性的抑制作用较弱,最大抑制程度为65％;对胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用较强,抑制程度最高可达95％以上,并且,它对pH及温度的变化均具有较强的稳定性。     

球孢白僵菌凝乳弹性蛋白酶(BbPr1)的纯化与特性*

以几丁质为底物,加入基本盐培养基中,诱导球孢白僵菌（Beauveriabassiana）产生分解昆虫表皮的蛋白酶。诱导物中,蝉蜕诱导的蛋白酶总活性、比活较高,经超滤、离子交换层析、亲和层析、制备性IEF电洗脱纯化了一种有凝乳弹性蛋白酶（Pr1）活性的蛋白酶BbPr1。经SDS－PAGE电泳银染后是单带,HPLC凝胶过滤显示单峰。BbPr1为单体酶,分子量为33.6kD左右,pI为7.4。底物专一性测定显示,BbPr1能水解Phe或Leu形成的酸胺键和肽键。BbPrl可被PMSF抑制,表明其活性中心有Ser残基;BbPr1还可被胰凝乳蛋白酶抑制剂TPCK和凝乳弹性蛋白酶抑制剂TEI等所抑制;胰蛋白酶抑制剂beupeptin和Epianstatin,及胃蛋白酶抑制剂Pepstain对BbPr1活性无影响。还研究了BbPr1的最适作用pH和pH稳定性。     

鸽β-防御素1基因的克隆及其生物学作用鉴定

【目的】从鸽子组织中克隆鸽子β-防御素1(AvBD1)基因,在大肠杆菌中表达重组鸽子AvBD1蛋白,测定其生物学特性。【方法】应用RT-PCR法从鸽子骨髓组织中扩增鸽子AvBD1基因,采用Real-time PCR法检测该基因在鸽子组织器官中的表达分布。将该基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pProEX-HTa的EcoR I和Xho I双酶切位点上,构建重组表达质粒pProEX-pigeon AvBD1,将重组质粒进行诱导表达;对该重组蛋白进行纯化,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸽子骨髓组织中克隆到鸽子AvBD1基因,其cDNA大小为198 bp,编码65个氨基酸,经序列相似性分析,鸽子AvBD1与鸭AvBD1氨基酸序列相似性最高(81.5%)。鸽子AvBD1主要分布于免疫系统和消化系统组织中。Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明,重组鸽子AvBD1蛋白分子量约8.8 kD,与预期大小一致。该重组蛋白具有广谱抗菌活性,高盐浓度显著降低其抗菌活性。此外,该重组蛋白的溶血活性极低。【结论】从鸽子骨髓组织中克隆到鸽子AvBD1基因,其主要分布在机体的免疫系统和消化系统中。该重组蛋白具有广谱抗菌活性,高盐浓度显著降低其抗菌活性,且该重组蛋白的溶血活性极低。     

光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin-FA72的克隆、表达及功能验证

【目的】本研究旨在对光滑鳖甲Anatolica polita borealis丝氨酸蛋白酶抑制剂基因进行克隆及表达分析,以验证光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能。【方法】利用PCR和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本性质进行预测和分析,同时构建其编码产物的系统进化树;构建光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白重组表达载体,表达、纯化蛋白进行功能验证。【结果】获得光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Ap Serpin-FA72(Gen Bank登录号:MF188125),其基因编码序列长为1 176 bp,编码由391个氨基酸残基组成的多肽,蛋白理论分子量为43.7 k D,理论等电点为5.14,包含一个由21个氨基酸组成的信号肽。As Serpin-FA72属亲水蛋白,分泌到胞外发挥作用,可能具有胁迫应答的功能,与赤拟谷盗Triboloum castaneum Serpin的同源性最高。纯化得到的融合蛋白Trx A-Ap Serpin-FA72大小约为63.7 k D。功能验证表明,重组蛋白Trx A-Ap SerpinFA72对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性均有抑制作用。【结论】光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达产物对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性具有抑制作用,表明其可能对消化类丝氨酸蛋白酶活性起抑制作用,对其功能活性的验证有助于深入研究Ap Serpin-FA72与丝氨酸蛋白酶之间的关系。     

Cry2Ab及Cry1Ac杀虫蛋白对棉铃虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确Cry2Ab和Cry1Ac2种Bt杀虫蛋白单用与混用对棉铃虫Helicoverpa armigera（Htibner）中肠主要蛋白酶活性的影响,本文测定了取食含不同Bt蛋白人工饲料后棉铃虫中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的差异。结果发现：Cry2Ab处理12h后对棉铃虫中肠总蛋白酶影响不大;对类胰蛋白酶的影响最大,除最高浓度处理外,其他浓度处理后棉铃虫类胰蛋白酶的活性明显高于对照;但对类胰凝乳蛋白酶活性的影响呈倒“V”字型,只有6．67ug／gCry2Ab处理后的棉铃虫酶活力显著高于对照,其他浓度处理与对照差异不显著或略低于对照;随着取食含Cry2Ab饲料时间的增加,棉铃虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性比对照显著增加;与对照相比,处理36h后类胰蛋白酶活性最高可增加到6．43倍。Cry1Ac处理棉铃虫12h后总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性都明显增加,而且与处理浓度呈正相关;但是24h后,处理后棉铃虫的总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性明显降低,只有类胰蛋白酶活性仍高于对照,但活性增长倍数低于12h时的处理。Cru2Ab和Cry1Ac2种蛋白混用处理棉铃虫后,2种酶的酶活力基本低于Cry1Ac和Cry2Ab单用的酶活力之和;只有2种蛋白浓度均为2．22ug／g混用时,处理12h后类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性高于2种蛋白单用时酶活力之和,且都显著的高于对照。     

蓖麻蚕不同组织脂酶同工酶的研究

本工作为蚕类同工酶研究中的一部分,研究了蓖麻蚕五龄幼虫不同组织器官酯酶的分布情况,试图逐渐建立酶谱化。目的在于利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,检验家蚕的DNA对蓖麻蚕的诱变作用（陈元霖等,1981）,以期供体、受体与转化体之间几种酶谱的异同,从分子生物学的角度对蚕类DNA诱导遗传性变异加以阐述。     

Comparative genetic diversity and genetic structure of three Chinese silkworm species Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae), Antheraea pernyi Guérin-Meneville and Samia cynthia ricini Donovan (Lepidoptera: Saturniidae)

The genetic diversity and genetic structure of three Chinese silkworm species Bombyx mori L., Antheraea pernyi Guérin-Meneville and Samia cynthia ricini Donovan were comparatively assessed based on RAPD markers. At the species level, A. pernyi and B. mori showed high levels of genetic diversity, whereas S. cynthia ricini showed low level of genetic diversity. However, at the strain level, A. pernyi had relatively highest genetic diversity and B. mori had lowest genetic diversity. Analysis of molecular variance (AMOVA) suggested that 60% and 72% of genetic variation resided within strains in A. pernyi and S. cynthia ricini, respectively, whereas only 16% of genetic variation occurred within strains in B. mori. In UPGMA dendrogram, individuals of A. pernyi and B. mori formed the strain-specific genetic clades, whereas those of S. cynthia ricini were distributed in a mixed way. The implications of these results for the conservation and utilization in breeding programs of three silkworm species are discussed.     

樗蚕丝腺5SrRNA的核苷酸顺序

本文用凝胶直读法、末端鉴定法等相配合,测定了樗蚕(Philosamia cynthia)絲腺5SrRNA的核苷酸顺序:AGACAACGUCCAUACCACGUUGAAAACACCGGUUCUCGUCCGAUCACCGAAGUCAAGCAACGUCGGGCGCGGUCAGUACUUGGAUGGGUGACCGCCUGGGAACACCGCGUGCUGUUGGCUU比较了樗蚕、蓖麻蚕、柞蚕、家蚕、果蝇等5SrRNA结构差异,在分子水平上探讨了昆虫的分化。     

管氏肿腿蜂毒液丝氨酸蛋白酶同源物SgSPH对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响

【目的】本研究旨在通过克隆表达管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液丝氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologue, SPH)基因SgSPH,探索其编码的毒液蛋白对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响。【方法】利用RT PCR技术克隆管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的开放阅读框(ORF),采用生物信息学软件分析其基因序列结构特征;采用qPCR技术检测该基因在不同发育阶段(卵、低龄幼虫、高龄幼虫、老熟幼虫、吐丝幼虫、黄茧蛹、黑茧蛹和羽化后1-5 d成虫)和雌成虫不同组织(头部、胸部、去除毒液器官的腹部和毒液器官)中的相对表达量;利用载体pSUMO Mut对该基因进行原核表达,用镍亲和层析柱纯化表达的重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot对获得的重组蛋白进行鉴定;用酶活性测定方法,分析SgSPH重组蛋白对寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹血淋巴酚氧化酶活性的抑制作用。【结果】克隆获得管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因(GenBank登录号: MT920663)的ORF,长798 bp,编码265个氨基酸,其中第1-20位氨基酸为信号肽,理论分子量为30.53 kD,等电点为9.59。多序列比对分析表明,SgSPH与其他寄生蜂毒液丝氨酸蛋白酶和SPH具有较低的氨基酸序列一致性(9%~17%),且缺乏保守的催化三联体。qPCR分析表明,SgSPH基因在管氏肿腿蜂成虫阶段和毒液器官中高表达。SDS-PAGE电泳和Western-blot检测发现,成功表达SgSPH重组蛋白,并纯化得到了高纯度SgSPH重组蛋白。酶活性检测结果显示,SgSPH能抑制寄主黄粉虫蛹血淋巴的酚氧化酶活性。【结论】结果提示管氏肿腿蜂毒液SgSPH具有干扰寄主酚氧化酶级联反应的功能。     

蓖麻蚕两种凝集素在蚕体内的出现与分布

蓖麻蚕Philosamia cynthia ricni血淋巴含两种凝集素,一种凝集兔新鲜红血球,凝血活力被L-鼠李糖和D-半乳糖抑制;另一种凝集戊二醛固定的人和鸡的红血球,凝血活力被岩藻糖抑制.它们在蚕的不同生长阶段及在蚕体各组织中的分布和凝血活力显著不同.血淋巴中这两种凝集素的凝血活力明显比其他组织中高.卵中测不到这两种凝集素活力.本文对这两种凝集素在蚕体中可能的生理功能进行了讨论.     

Prothoracicotropic activity of SBRPs, the insulin-like peptides of the saturniid silkworm Samia cynthia ricini

Synthesis and secretion of the insect molting hormone ecdysteroid in the prothoracic glands (PGs) are stimulated by the prothoracicotropic hormone (PTTH) secreted by the brain. Bombyxins, insulin-like peptides of the silkworm Bombyx mori, show prothoracicotropic activity when administered to the saturniid silkworm Samia cynthia ricini, but they are inactive to B. mori itself. Recently, the genes for the bombyxin homologs of S. cynthia ricini (referred to as Samia bombyxin-related peptides, SBRPs) were cloned. To examine the prothoracicotropic activity of SBRPs on S. cynthia ricini, we synthesized two representative molecules, SBRP-A1 and -B1. They promoted pupa-to-adult development with ED(50) of 50 and 10 ng/pupa (EC(50) of 5 and 1 nM), respectively.     

野桑蚕、蓖麻蚕及家蚕基因组的RFLP分析

以家蚕Bombyx mori丝素重链基因、丝胶基因1和胰凝乳蛋白酶抑制因子13基因为探针,对野桑蚕B.mandarina、蓖麻蚕Philosamia cynthia ricini和家蚕B.mori基因组DNA进行限制性片段长度多态性分析。结果发现,在野桑蚕、蓖麻蚕基因组中存在着家蚕丝素重链基因、丝胶基因1的同源序列,而在中日野桑蚕以及蓖麻蚕品种间存在着限制性酶切位点差异;丝胶基因1在中国野桑蚕基因组的EcoRⅠ酶切图谱较日本野桑蚕与家蚕更为一致,表明家蚕与中国野桑蚕亲缘关系更近。此外,在野桑蚕基因组中发现了家蚕胰凝乳蛋白酶抑制因子13基因的同源序列,并且在家蚕品种间以及中日野桑蚕之间也存在着多态性。这些结果表明不同绢丝昆虫在适应生存环境的进化过程中,基因组发生了结构改变。     

氟铃脲对斜纹夜蛾酚氧化酶活性的影响

【目的】探讨氟铃脲对斜纹夜蛾Spodoptera litura酚氧化酶活性的影响.【方法】应用酶动力学法,在确定斜纹夜蛾酚氧化酶最适反应条件基础上,测定氟铃脲与酚氧化酶直接作用及氟铃脲处理幼虫后酚氧化酶的活性.【结果】以邻苯二酚为底物,斜纹夜蛾酚氧化酶的最适pH 6.5,最适温度30℃.氟铃脲没有和酚氧化酶结构中的铜离子结合,而是直接与酶蛋白发生作用.氟铃脲浓度低于1 153 mg/L对离体酚氧化酶有激活作用,在138 mg/L激活作用最大,浓度高于1 153 mg/L则产生抑制作用.用46 mg/L和92 mg/L亚致死剂量氟铃脲连续处理5龄幼虫不同时间后,酚氧化酶活性均显著提高,且高浓度的激活作用大于低浓度的激活作用.进一步测定药剂处理幼虫24,48和72 h的血淋巴、表皮和头部酚氧化酶活性,随着氟铃脲处理时间延长,两个剂量的氟铃脲对血淋巴、表皮及头部酚氧化酶的激活作用逐渐增大,氟铃脲对血淋巴酚氧化酶的激活作用最大,表皮次之,头部最低.氟铃脲处理幼虫后,其预蛹和蛹酚氧化酶的活性也显著提高,表现出一定的后效应.【结论】一定浓度范围内,氟铃脲对斜纹夜蛾酚氧化酶具有激活作用.     

蓖麻蚕后部丝腺体丙氨酸-tRNA和甘氨酸-tRNA同功受体相对含量的变化

用氨基酸选择性地保护相应的tRNA同功受体,使其3′端羟基不被过碘酸氧化,去氨酰化后用³²pCp标记、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的方法,分析了蓖麻蚕后部丝腺体tRNA^Ala和tRNA^Gly同功受体相对含量的变化。从5龄期24小时到85小时,这两种tRNA同功受体的数目和电泳相对位置没有明显变化,tRNA^Ala主要分为四个同功受体,tRNA^Gly主要为三个。tRNA^Ala同功受体的相对含量有变化,其中tRNA₃^Ala增加10%,tRNA₂^Ala下降11%,tRNA^Gly同功受体的相对含量无明显变化。     

蓖麻蚕卵黄原蛋白cDNA的克隆及序列分析

本文论述了蓖麻蚕卵黄原蛋白cDNA迅速克隆化的方法,SDS－PAGE鉴定的蓖麻蚕卵黄原蛋白由大小二个亚基构成,求出的分子量大亚基为180kDa,小亚基为45kDa,从解析的蓖麻蚕卵黄原蛋白氨基酸序列推算的分子量大亚基为161．06kDa,小亚基为40．53kDa,如果考虑到翻译后的修饰,这与SDS－PAGE求出的分子量是吻合的。蓖麻蚕卵黄原蛋白cDNA是由5788pb构成,一个ORF为5337个碱基,编码了1779个氨基酸。在信号肽的15个氨基酸残基中,有12个是硫水性氨基酸残基。这与其他昆虫卵黄原蛋白信号肽区域的硫水性分析是一致的。蓖麻蚕卵黄原蛋白N-linked glycosylation site的分布与家蚕、柞蚕和天蚕不同,3处N-linked glycosylation site存在于大亚基里,2处地多聚丝氨酸区域上流的小亚基里。另外,我们发现在所解析的柞蚕、天蚕的蓖麻蚕卵黄原蛋白氨基酸序列的C－末端区域里DGQR、GICG功能部位及其后的6个半胱氨酸都完好地保存。