柔嫩艾美耳球虫HSP基因的克隆、表达及鉴定

为研究柔嫩艾美耳球虫热激蛋白(Heat shock proteins,HSPs)的生物学特性,应用RACE和RT-PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫子孢子中首次克隆获得了EtHSP的全长cDNA(GenBank Accession No.FJ911605)。EtHSP包含一个1455 bp的开放阅读框,编码484个氨基酸,预测表达蛋白的分子量大小为53.5 kD。应用Real-time PCR对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析,发现该基因在子孢子阶段的表达明显高于其他阶段。同时,构建了原核表达重组质粒pET28a(+)-EtHSP,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,重组质粒pET28a(+)-EtHSP在大肠杆菌中以包涵体形式表达,经1 mmol/L IPTG诱导6 h后的表达量最高,该蛋白可被抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示:从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。     

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交（SSH）技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示：从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。     

柔嫩艾美耳球虫保守蛋白CHP559基因克隆与真核表达

为构建柔嫩艾美耳球虫保守蛋白Et CHP559基因的真核表达重组质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,并转染DF-1细胞进行表达。利用5'RACE技术克隆获得了柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因全长c DNA序列,该基因全长为1 746 bp,ORF为104-1 327 bp,编码407个氨基酸,编码蛋白的分子量约为46 k D,并利用生物信息学分析该基因编码蛋白的性质、结构等特征,发现该蛋白含有跨膜结构和信号肽。通过RT-PCR扩增得到含完整开放阅读框的基因片段,并将其与真核表达载体pc DNA3.1-flag连接,构建了真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,所构建的真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559经过PCR和双酶切鉴定,可见一条大小约为1 224 bp的目的条带;重组质粒转染DF-1细胞后,免疫印迹检测可见大小约为47 k D的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验显示在DF-1细胞中检测到绿色荧光。这些研究结果表明已成功获得了Et CHP559的全长序列,并成功构建了Et CHP559的真核重组表达质粒,在真核细胞DF-1中获得表达,为深入研究Et CHP559的功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达.将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3.重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞.重组酵母细胞在含1％甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4d的部分上清.经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD.Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合.结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达.     

烟实夜蛾触角化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

利用RT-PCR技术扩增了编码烟实夜蛾 Helicoverpa assulta 触角化学感受蛋白（chemosensory protein）的全长cDNA。克隆和测序结果表明,烟实夜蛾化学感受蛋白基因核苷酸序列全长384 bp(GenBank序列号： DQ285667),编码127个氨基酸残基,预测N-末端包含16个氨基酸组成的信号肽序列,因此估测其成熟蛋白分子量为12.97 kD,等电点为5.32。将该基因重组到表达载体pGEX-4T₂中,并转入原核细胞中进行表达。SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导后,烟实夜蛾化学感受蛋白基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条约39 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。     

番茄交替氧化酶基因的克隆和表达

利用简并PCR扩增产物做探针筛选番茄cDNA基因文库获得一个全长交替氧化酶cDNA基因LeAoxlau.经序列分析得出,该基因全长1 418bp,编码区序列长1 077 bp,编码约40 kD的前体蛋白.该蛋白在转运到线粒体时被加工成32kD的成熟蛋白.Southern印迹杂交分析结果显示该基因以单拷贝形式存在于番茄的基因组中RT-PCR显示,该基因在在番茄植株的根、茎、叶和子叶中表达.重组表达实验表明该基因能在大肠杆菌中表达.     

柞蚕14-3-3基因的鉴定及表达分析

14-3-3蛋白是一种可以改变其结合蛋白构象的酸性蛋白质.柞蚕14-3-3 cDNA序列全长1 220 bp,包括一个126 bp的5'非编码区和一个350 bp的3'非编码区.该基因的开放读码框长度为744 bp,编码247个氨基酸.序列比对结果表明,柞蚕14-3-3蛋白与家蚕的14-3-3蛋白具有高度同源性.此外对柞蚕14-3-3基因进行了原核表达和重组蛋白纯化.SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,分子量大小约32 kD的重组蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

鸡球虫Etp28基因的克隆及其在杆状病毒系统中的表达

本文克隆了鸡柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌａ）广东株子孢子折光体抗原Ｅｔｐ２８基因,与国外发表的柔嫩艾美耳球虫ＭｅｒｃｋＬＳ１８株比较,仅在第４９２位有一个属于同义突变的碱基变异（Ｃ→Ｔ）。随后在修饰的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ－）载体系统中得到了高效表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明表达产物为５３ｋＤ的融合蛋白ＧＳＴ－６×Ｈｉｓ－Ｅｔｐ２８,其产物占细胞总蛋白量的２１．３％,在草地夜蛾培养细胞（Ｓｆ９）中的得量为０．４２ｍｇ／Ｌ×１０６个细胞。免疫保护效果实验初步结果表明该重组抗原能够提供一定的抗球虫保护作用。     

苏云金芽孢杆菌chiA,chiB全基因的克隆、表达及其序列分析

以苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株基因组DNA为模版,用touchdown PCR方法扩增几丁质酶ChiA和ChiB的全基因序列(GenBank登录号:EF103273和DQ512474)。将PCR产物连接pUCm-T克隆载体,获得重组质粒pUCm-chiA和pUCm-chiB,分别转化E.coliXL-Blue。克隆的几丁质酶基因可以利用本身的启动子异源表达各自的蛋白,不需要几丁质作为诱导物。表达的几丁质酶能够分泌到胞外。证明15A3菌株可组成型表达2种几丁质酶。经核苷酸及氨基酸序列分析证明,chiA基因全长1426bp,含有343bp的上游非编码区和1083bp的ORF,编码360个氨基酸。推测成熟蛋白分子量为36kD,只有一个几丁质酶催化域。chiB基因全长2279bp,含有248bp的上游非编码区和2031bp的ORF,编码676个氨基酸。推测成熟蛋白分子量约为70.6kD,具有三个功能域。核苷酸序列分析显示chiA和chiB的启动子所处的位置及转录起始碱基都不相同,-35区相同,而-10区有两个碱基不同,SD序列也不完全一致。