菜粉蝶热激蛋白70(HSP70)基因的分子特性及其对杀虫剂胁迫的响应

【目的】明确菜粉蝶Pieris rapae热激蛋白70(HSP70)基因的分子特性及其对杀虫剂胁迫的响应,为探索菜粉蝶HSP70基因在抵御杀虫剂胁迫中的功能提供前期基础。【方法】利用同源检索方法,从菜粉蝶转录组数据中鉴定HSP70基因;使用生物信息学方法分析HSP70基因的分子特性;采用实时荧光定量PCR技术分析HSP70基因在菜粉蝶不同发育阶段(2-5龄幼虫、蛹和雌雄成虫)、4龄幼虫不同组织(中肠、马氏管、脂肪体和体壁)以及LD₂₀剂量高效氯氟氰菊酯(0.12 ng/μL)和氯虫苯甲酰胺(1.04 ng/μL)胁迫下4龄幼虫体内的表达谱。【结果】从菜粉蝶转录组中鉴定了3个HSP70基因(PrHsp70-1, PrHsp70-2和PrHsp70-3) (GenBank登录号分别为MW691114, MW691115和MW691116),它们分别编码628, 630和653个氨基酸,分子量分别为68.7, 69.2和71.7 kD。生物信息学分析结果表明,3个PrHSP70蛋白均为胞质蛋白,且均含有HSP70家族的特征序列。PrHsp70-1和PrHsp70-2无内含子,而PrHsp70-3含有1个内含子。随着幼虫龄期的增加,PrHsp70-1和PrHsp70-2的表达量也不断上调,但在蛹期和成虫期下调;PrHsp70-3在供试的不同发育阶段样本中的表达量无显著差异。PrHsp70-1高量表达于幼虫脂肪体,PrHsp70-2高量表达于幼虫中肠,PrHsp70-3在幼虫体壁和脂肪体中表达量均较高。LD₂₀剂量高效氯氟氰菊酯和氯虫苯甲酰胺均能诱导3个PrHsp70基因显著上调表达,但不同基因的响应速度有差异;此外,LD₂₀剂量高效氯氟氰菊酯处理24 h后,PrHsp70-3显著下调表达。【结论】PrHsp70基因可能在菜粉蝶生长发育以及抵御杀虫剂胁迫中均有重要作用。     

牧草盲蝽CYP6A13和钠离子通道LPVSSC基因的克隆及参与高效氯氟氰菊酯的抗性分析

昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性主要是解毒酶活性的增强和钠离子通道的敏感度降低所致。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了牧草盲蝽Lygus pratensis P450 CYP6A13基因（GenBank登录号：MN782520）及钠离子通道LPVSSC基因cDNA全长序列（GenBank登录号：MW821485）。其中CYP6A13基因全长2 003 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子质量为57.2 kDa,主要位于细胞内质网,等电点为5.77,无跨膜区和信号肽,存在血红素结合保守功能区。同源比对与系统进化分析表明,牧草盲蝽的CYP6A13与分类学关系上较为接近的昆虫同源蛋白间高度相似。钠离子通道序列LPVSSC开放阅读框6 072 bp,编码2 024个氨基酸,预测蛋白分子质量为228.94 kDa,等电点为4.99,无信号肽,有多个跨膜区域,4个同源结构域（I~IV）,每个结构域有6个跨膜片段（S1~S6）,存在MFM基序。基因表达谱结果表明：CYP6A13在牧草盲蝽成虫头部的表达量高于胸、腹部;室内筛选的高效氯氟氰菊酯抗性R14、R6品系的CYP6A13表达量是敏感品系的18.74和5.45倍;CYP6A13表达量在雌、雄成虫之间无显著差异;不同发育期基因表达量为：初羽化成虫>5龄若虫>4龄若虫>3龄若虫>2龄若虫>1龄若虫。测序比对高效氯氟氰菊酯抗性与敏感品系的钠离子通道序列IIS4~IIS6区域,未发现存在可能导致靶标抗性的氨基酸突变。结果表明CYP6A13基因过表达可能导致了牧草盲蝽对高效氯氟氰菊酯的抗药性,为深入解析CYP6A13基因介导抗药性的功能研究奠定基础。     

高效氯氟氰菊酯和噻虫嗪对红火蚁的室内毒力

[背景]高效氯氟氰菊酯和噻虫嗪是农业上常用的杀虫剂。[方法]在室内测定了0.25 g·L-1高效氯氟氰菊酯微囊悬浮剂和0.01%噻虫嗪胶饵对红火蚁的毒力。[结果]高效氯氟氰菊酯微囊悬浮剂对红火蚁有良好的触杀作用,触杀时间短,致死量大,具备毒力传导作用;噻虫嗪胶饵能通过虫体间交哺传导毒力,室内防治整巢红火蚁效果可达93.50%以上。[结论与意义]这2种药剂都具有有效防治红火蚁的潜力。     

我国白纹伊蚊对三种拟除虫菊酯类杀虫剂抗性检测诊断剂量的建立

【目的】建立中国白纹伊蚊Aedes albopictus成蚊对溴氰菊酯、氯菊酯和高效氯氟氰菊酯杀虫剂抗性检测的诊断剂量。【方法】应用溴氰菊酯、氯菊酯和高效氯氟氰菊酯原药制作不同浓度的药膜滤纸,接触筒法测定白纹伊蚊实验室敏感品系成蚊对3种拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性,记录1 h的击倒数和24 h的死亡数。应用Excel 2007和SPSS20.0进行数据统计处理,并制作杀虫剂的毒力回归线,计算各自的LC_(50)和LC_(99)值。以2倍LC_(99)值作为区分抗性和敏感种群的诊断剂量,制作药膜滤纸,接触筒法生物测定海口市白纹伊蚊现场种群成蚊对杀虫剂的抗药性。【结果】溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯和氯菊酯杀虫剂对白纹伊蚊实验室敏感品系成蚊的LC_(50)值分别为0.00619%,0.01403%和0.05009%,LC_(99)值分别为0.05175%,0.11859%,和0.53165%,相对应的诊断剂量分别为0.1035%,0.2372%和1.0633%。应用上述溴氰菊酯、氯菊酯和高效氯氟氰菊酯诊断剂量测定的海口市白纹伊蚊现场种群的死亡率分别为22.58%,36.29%和40.83%,表明该种群对这3种菊酯类杀虫剂均已产生了抗性。【结论】本研究建立的白纹伊蚊对3种拟除虫菊酯类杀虫剂的诊断剂量可作为该蚊成蚊抗药性监测的参考。     

5种杀虫剂对入侵害虫椰子织蛾的室内毒力测定

椰子织蛾是一种外来新入侵害虫,对棕榈科植物造成了严重危害。采用叶片浸渍法测定了甲维盐等5种杀虫剂对入侵害虫椰子织蛾5～6龄幼虫的室内毒力。5种药剂处理72 h后的室内毒力大小顺序为甲维盐＞氯虫苯甲酰胺＞毒死蜱＞高效氯氟氰菊酯水乳剂＞烟碱;72 h 致死中浓度（ LC50）为5．2604、9．7126、24．8202、104．0584、643．1496 mg· L-1。选取同样毒力效果所需成本依次为毒死蜱＜甲维盐＜高效氯氟氰菊酯＜氯虫苯甲酰胺＜烟碱。本研究可用于指导椰子织蛾的应急化学防控。综合毒力和成本,建议在生产上采用毒死蜱和甲维盐等相关药剂防治椰子织蛾。     

人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 ,为下阶段深入AWP1功能研究提供了重要的基础     

禾谷缢管蚜阳离子通道基因RSC1的克隆、分子特性及诱导表达分析

【目的】SC1通道(sodium channel 1)是昆虫体内一种重要的离子通道,被认为是一种开发新型杀虫剂的神经靶标。本研究拟克隆禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi的SC1通道基因,并初步分析其生理功能及其与SC1类通道、电压门控钠离子通道、电压门控钙离子通道的进化关系。【方法】采用RT-PCR技术,克隆了禾谷缢管蚜SC1基因完整的开放阅读框;利用实时荧光定量PCR技术,分析禾谷缢管蚜成蚜在不同浓度的高效氯氟氰菊酯诱导下SC1基因表达变化。【结果】获得了禾谷缢管蚜SC1基因(命名为RSC1)完整的开放阅读框(Gen Bank登录号为KU640190),其长度6 687bp,编码2 228个氨基酸。RSC1具有SC1通道的结构特征,有一个不同于电压门控钠离子通道和电压门控钙离子通道的特殊DEEA模体(motif)。系统进化分析结果显示,RSC1与电压门控钠离子通道组成一个进化枝,电压门控钙离子通道组成另外一个进化枝,SC1与电压门控钠离子通道在进化上有更近的起源关系。实时荧光定量PCR分析结果表明,LC15,LC35和LC503种剂量的高效氯氟氰菊酯处理6 h后,禾谷缢管蚜RSC1基因表达量相对于清水对照显著下调,表达量分别为对照的0.57,0.82和0.78倍;3种剂量的高效氯氟氰菊酯处理24 h后,禾谷缢管蚜RSC1基因表达量分别为对照的2.19,1.33和1.19倍,其中LC15(0.1484 mg/L)胁迫下RSC1基因的表达量显著上调。【结论】SC1类通道与电压门控钠离子通道在进化起源上有更近的关系。RSC1通道可能是高效氯氟氰菊酯的次级靶标。由于RSC1和其同源基因只存在于节肢动物中,脊椎动物尚未发现该类基因,因此这类通道可能作为开发新型杀虫剂的神经靶标。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

甜菜夜蛾抗高效氯氟氰菊酯近等基因系的构建

将甜菜夜蛾Spodoptera exigua抗性种群雄成虫与敏感种群雌成虫杂交,杂交后代再自交后,用高效氯氟氰菊酯杀死敏感和部分杂合个体的剂量(50 μg/mL)处理4龄幼虫,对1天后存活的幼虫再用250 μg/mL汰选,将存活幼虫发育成的雄成虫与敏感种群的雌成虫回交,再经自交和选育,如此循环6次,获得了甜菜夜蛾抗高效氯氟氰菊酯近等基因系。对该基因系构建过程中各代幼虫的抗性水平和相关生物学特性进行了监测和比较,结果表明获得的抗高效氯氟氰菊酯近等基因系抗性种群的抗药性仍保持较高水平;酯酶同工酶的电泳分析表明抗高效氯氟氰菊酯近等基因系抗性种群与敏感种群图谱相近,而与亲本抗性种群之间存在明显差异。     

植物防御信号物质JA/SA对桃蚜解毒酶谷胱甘肽-S-转移酶及唾液腺基因C002表达诱导反应

茉莉酸(JA)与水杨酸(SA)为植物体内重要的防御反应信号物质,在植株受到机械损伤或病虫害侵害时可作为信号物质,激活下游相关防御反应.为应对植株的防御反应,昆虫通常通过提高自身相关解毒酶活性或分泌唾液蛋白调节寄主防御反应以增强对寄主植株适应性.本研究以桃蚜(Myzus persicae(Sulzer))体内的重要解毒酶谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的sigma型及唾液腺特异表达基因C002为研究对象,分别以含有5 mmol/L JA或10 mmol/L SA的人工饲料直接饲喂桃蚜,在不同的取食时间点收集蚜虫,通过荧光定量PCR检测JA或SA对目的基因sigma GST及C002表达诱导反应.结果发现,当桃蚜直接取食含有JA或SA的人工饲料后,sigma GST及C002表达量都显著升高.表明,桃蚜可直接利用寄主植株防御反应信号物质JA或SA,提高体内相关解毒酶或者唾液蛋白基因表达量,以提高对寄主防御的适应性.为进一步开展桃蚜对植物防御反应适应性研究提供新的思路.