沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】表皮蛋白是昆虫体壁的主要组成部分,在昆虫生长发育中起着重要的作用。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因,分析其表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育中的作用提供必要的基础。【方法】根据本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用生物信息学方法鉴定表皮蛋白基因全长开放阅读框(ORF);采用RT-qPCR技术测定鉴定的8个表皮蛋白基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和3龄幼虫不同组织(头部、体壁、消化道和脂肪体)中的表达谱。【结果】基于转录组数据鉴定到8条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为GdauCP1-8(GenBank登录号: MN629000-MN629007),ORF长417~810 bp,编码138~269个氨基酸,预测分子量为15~28 kD,等电点pI为4.45~8.62;具有16~20个氨基酸的信号肽;GdauCP1具有典型的跨膜结构,其余7个GdauCP蛋白无跨膜结构。同源序列比对和系统发育分析表明,GdauCP3与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CP的氨基酸序列一致性最高,为60.00%;其余的GdauCPs与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera CP的氨基酸序列一致性最高,为58.52%~80.00%。GdauCP1-4属于RR-2亚家族,GdauCP5-7属于RR-1亚家族,GdauCP8的亚家族归属未确定。RT-qPCR分析表明,8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及3龄幼虫不同组织内均有表达,且表达量存在显著差异。GdauCP2, GdauCP4, GdauCP5和GdauCP6在1龄幼虫期高表达,GdauCP3, GdauCP7和GdauCP8在蛹期高表达,GdauCP1在3龄第3天幼虫期高表达;除GdauCP2在成虫中表达水平较高外,其他GdauCP基因在成虫中的表达水平均很低。GdauCP1在头部和体壁中高表达,GdauCP2和GdauCP8在脂肪体中高表达,GdauCP3, GdauCP4, GdauCP6和GdauCP7在消化道中高表达,而GdauCP5在体壁中高表达。【结论】8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和组织间差异表达,且表达模式不同,意味着不同GdauCP可能具有不同的功能。     

牧草盲蝽CYP6A13和钠离子通道LPVSSC基因的克隆及参与高效氯氟氰菊酯的抗性分析

昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性主要是解毒酶活性的增强和钠离子通道的敏感度降低所致。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了牧草盲蝽Lygus pratensis P450 CYP6A13基因（GenBank登录号：MN782520）及钠离子通道LPVSSC基因cDNA全长序列（GenBank登录号：MW821485）。其中CYP6A13基因全长2 003 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子质量为57.2 kDa,主要位于细胞内质网,等电点为5.77,无跨膜区和信号肽,存在血红素结合保守功能区。同源比对与系统进化分析表明,牧草盲蝽的CYP6A13与分类学关系上较为接近的昆虫同源蛋白间高度相似。钠离子通道序列LPVSSC开放阅读框6 072 bp,编码2 024个氨基酸,预测蛋白分子质量为228.94 kDa,等电点为4.99,无信号肽,有多个跨膜区域,4个同源结构域（I~IV）,每个结构域有6个跨膜片段（S1~S6）,存在MFM基序。基因表达谱结果表明：CYP6A13在牧草盲蝽成虫头部的表达量高于胸、腹部;室内筛选的高效氯氟氰菊酯抗性R14、R6品系的CYP6A13表达量是敏感品系的18.74和5.45倍;CYP6A13表达量在雌、雄成虫之间无显著差异;不同发育期基因表达量为：初羽化成虫>5龄若虫>4龄若虫>3龄若虫>2龄若虫>1龄若虫。测序比对高效氯氟氰菊酯抗性与敏感品系的钠离子通道序列IIS4~IIS6区域,未发现存在可能导致靶标抗性的氨基酸突变。结果表明CYP6A13基因过表达可能导致了牧草盲蝽对高效氯氟氰菊酯的抗药性,为深入解析CYP6A13基因介导抗药性的功能研究奠定基础。     

沙葱萤叶甲卵滞育的转录组学分析

【目的】建立沙葱萤叶甲Galeruca daurica滞育卵转录组数据库,挖掘卵滞育相关的基因以及代谢和信号通路,在转录组水平探讨卵滞育的分子机制。【方法】采用Illumina NovaSeq6000高通量测序平台对沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵进行转录组测序,并进行生物信息学分析;利用DESeq软件分析沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵中的差异表达基因,对差异表达基因进行KEGG通路富集分析;利用qRT PCR技术对10个差异表达基因的表达模式进行验证。【结果】基于沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵转录组测序结果,共获得53 389个unigene,其中差异表达基因2 145个,24个差异表达基因与保幼激素信号及脂肪酸生物合成和降解相关。与解除滞育卵相比,滞育卵转录组中1 297个基因上调表达,富集于124条KEGG通路,其中核糖体通路显著富集;848个基因下调表达,富集于73条KEGG通路,其中MAPK信号通路和糖胺聚糖生物合成通路显著富集。qRT-PCR结果表明,随机选取的10个差异表达基因的表达趋势与RNA-Seq转录组测序结果完全一致。【结论】保幼激素,脂肪酸生物合成和降解,核糖体,MAPK信号及糖胺聚糖生物合成等通路可能在沙葱萤叶甲卵滞育调控中起着重要的作用。     

沙葱萤叶甲核糖体蛋白基因GdRpS3a的克隆、分子特性及表达分析

核糖体蛋白(ribosomal protein,Rp)是一类参与蛋白质合成、细胞代谢、机体免疫及信号传导等重要功能的蛋白质.本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica核糖体蛋白S3a基因cDNA全长序列,分析其分子特性和表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用提供必要的基础.根据现有的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了沙葱萤叶甲RpS3a基因的全长cDNA序列,命名为GdRpS3a(GenBank登录号:MN660144).该基因全长为800 bp,开放阅读框全长为687 bp,编码228个氨基酸,具有核糖体蛋白S3a家族的保守功能域;预测分子量为25.63 kDa,等电点pI为10.53,无信号肽和跨膜结构.同源序列比对和系统发育分析表明,GdRpS3a与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera RpS3a的亲缘关系最近,其氨基酸序列一致性最高为54.10％.采用qPCR技术检测该基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1～3龄幼虫、预蛹、蛹及成虫羽化3、7、10、15、25、40、60、80和100 d)和3日龄成虫在不同温度(0、5、10、15、20、25、30、35和40℃)处理1h后的表达谱.结果 表明:GdRpS3a在不同发育阶段的沙葱萤叶甲体内均有表达,在成虫滞育结束后表达量最高,在卵期和成虫滞育期间低表达.温度对GdRpS3a的表达有显著的影响,30℃下最高,0℃下最低.GdRps3a的表达与沙葱萤叶甲生长发育阶段及环境温度有关,可能在沙葱萤叶甲成虫夏滞育中起着重要作用.