脊髓灰质炎Ⅲ型病毒RNAT1-寡核苷酸指纹图谱的比较

制备了4株(京6和昆1、4、14)Polio 3型野毒株的RNA T1-寡核苷酸图谱,并与中Ⅱ2疫苗株的图谱做了比较。与中Ⅲ 2株图谱相比,京6和昆4株分别有5个和14个点不同,而昆1和昆14株则完全不同。这表明;Polio 3型病毒RNAT1-寡核苷酸图谱为区分Polio 3型野毒株和疫苗相关株,提供了较可靠的依据。     

利用单克隆抗体对乙型脑炎病毒不同毒株抗原分析的研究

实验发现,应用动物免疫血清(多克隆抗体,PcAb)进行抗原分析时,我国分离到的乙型脑炎病毒SA14、P3、A2和高株的抗原性无明显差别,与从日本分离到的中山株有些差别,但仍被PcAb所中和;而用单克隆抗体(McAb)进行分析,情况就明显不同:SA14和P3株抗原性相似,高株和中山株不能被51-8McAb所中和,A2株则介于两者之间。A2和高顺生株的寡核苷酸指纹图谱分析表明,高株比A2株多两个斑点,但大多数斑点是一样的,证实了上述结果。实验还发现不同毒株的保护效果不同,A2株的免疫效果明显优于高株。     

用乙脑病毒减毒株单克隆抗体分析乙脑病毒强毒株和减毒株的抗原差别

用乙型脑炎(乙脑)病毒强毒株免疫制备的单克隆抗体(McAb)分析证明强毒株之间的抗原差别,已有研究报道。本实验用乙脑病毒减毒活疫苗2-8株免疫制备的McAb分析强毒株和减毒株之间的抗原差别。 一、乙脑病毒株 2-8株和5-3株均为减毒活疫苗株。SA14株和A2株均为强毒株,SA14株是2-8株和5-3株的母株,A2株是国内实验室标准株。     

广东省10株乙型脑炎病毒的分子特征研究

了解广东省目前流行的乙型脑炎病毒的基因型别,以及新分离毒株与P3和SA14-14-2疫苗株E蛋白的氨基酸差异,推测疫苗株的可能保护效果。本研究对广东省2017年从蚊虫和蠓虫标本分离的10株乙型脑炎病毒基因组序列测定,利用MEGA软件登录GenBank下载乙型脑炎病毒代表株序列并绘制进化树,同时用ClustalW2软件与疫苗株进行氨基酸同源性比对和E蛋白的序列分析。10株乙型脑炎病毒均属基因I型GI-b组,但分别位于2个不同的、小的进化分枝中。10株新分离病毒与P3和SA14-14-2疫苗株的E蛋白氨基酸同源性分别位于97.40%~97.60%和97.20%~97.40%之间。E基因区段500个氨基酸中,P3株与新分离乙型脑炎病毒株之间共存在17个氨基酸位点的差异(包括12个共同氨基酸的改变),略高于SA14-14-2疫苗株的16个氨基酸位点变异(包括11个共同氨基酸的改变)。其中在DI区的P3和SA14-14-2株分别有1个和3个共同氨基酸变异,DⅡ区各有5个共同氨基酸改变,DⅢ区分别有5个和2个共同氨基酸改变,结构域之外各有1个共同氨基酸的变异。绝大多数变异发生在非关键位点,只在E306和E388处观察到的氨基酸位点变异与疫苗P3株关键位点的改变有关,这两个位点(G306E,E388G)均发生在DⅢ区,而疫苗SA14-14-2未观察到关键位点的改变。总之,广东省流行的乙型脑炎病毒基因型别可能已由Ⅲ型变为I型;疫苗SA14-14-2株及P3株与新分离毒株均具有很高的同源性,绝大多数关键氨基酸位点未发生变异,对新分离病毒均具有良好的免疫保护价值。     

乙型脑炎病毒减毒中间株SA14-12-1-7基因组全序列的测定

本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14-12-1-7-12 -1-7株进行全序列测定和分析,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制.根据 已发表的SA14-12-1-7株及SA14-12-1-7株的序列,设计6对重叠引物,涵括整个乙脑病 毒的基因组,通过RT-PCR扩增出SA14-12-1-7-12-1-7株的各cDNA片段,分别克隆到pGEM -T载体,转化至TG1受体菌中,挑取阳性克隆进行鉴定后测序.结果表明SA14-12-1-7-12- 1-7株基因组全序列长10976个核苷酸,从96到10394为一个长开放读码框,编码3432个氨基 酸.与野毒株SA14-12-1-7和疫苗株SA14-12-1-7的核苷酸序列和氨基酸序列相比,同 源性均在99%以上,突变位点分散于各个区域,E区有5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关.此 外,NS3、NS5和3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关.综上所述,乙脑病毒减毒中 间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性.全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义.     

中国流行性乙型脑炎病毒表型和基因型的研究进展

流行性乙型脑炎(乙脑)病毒是引起病毒性脑炎最主要的病毒之一,本文对我国分离株的表型和基因型特性进行了综合分析。生物学特征研究显示,不同毒株间存在空斑形态、小鼠神经侵入致病性、保护性抗原和血凝性的明显差异。中国在1977年前,自然界中仅存在基因Ⅲ型乙脑病毒,但自1977年以后基因Ⅰ型和Ⅲ型病毒均从自然界分离到,而基因Ⅰ型病毒已成为优势病毒,其中多数分离自蚊虫。基因序列分析显示,两种基因型的氨基酸序列差异率很小(≤3%),与当前广泛应用的减毒活疫苗株比较,仅≤3%的氨基酸序列差异率,这些差别主要存在于与SA14-14-2减毒相关的位点,提示SA14-14-2疫苗能够有效地保护这两种基因型毒株的感染。     

乙型脑炎病毒减毒中间株SA14—12—1—7基因组全序列的测定

本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14 12 1 7株进行全序列测定和分析 ,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制。根据已发表的SA14 14 2株及SA14 株的序列 ,设计 6对重叠引物 ,涵括整个乙脑病毒的基因组 ,通过RT PCR扩增出SA14 12 1 7株的各cDNA片段 ,分别克隆到pGEM T载体 ,转化至TG1受体菌中 ,挑取阳性克隆进行鉴定后测序。结果表明SA14 12 1 7株基因组全序列长 10 976个核苷酸 ,从 96到 10 394为一个长开放读码框 ,编码 3432个氨基酸。与野毒株SA14 和疫苗株SA14 14 2的核苷酸序列和氨基酸序列相比 ,同源性均在 99%以上 ,突变位点分散于各个区域 ,E区有 5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同 ,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关。此外 ,NS3、NS5和 3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关。综上所述 ,乙脑病毒减毒中间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列 ,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义     

乙型脑炎病毒野毒株及其不同株减毒株E蛋白基因序列比较

为了解乙脑减毒活疫苗株SA14-12-1-7的神经毒力减毒机 制,用RT-PCR方法分别扩增不同减毒程度毒株的E基因,克隆、测序,继而对各毒株序列进 行比较.结果表明SA14-12-1-7强毒株与SA14-12-1-7-12-1-7株间只有3个氨基酸发生改变( E-107,E-176,E-439),SA14-12-1-7-12-1-7与SA14-12-1-7-9-7和SA14-12-1-7-5-3 株间有另3个氨基酸发生改变(E-138,E-279,E-315).SA14-12-1-7-9-7株与SA14-12-1-7-5-3株只有一个核苷酸NT -405不同,但未引起氨基酸改变.SA14-12-1-7疫苗株除保留SA14-12-1-7-12-1-7和SA14-12-1-7-9-7所改变的6个氨基酸外,另有2个氨基酸发生了改 变(E-177,E-264),共计在E区共发生8个氨基酸的替代.SA14-12-1-7-12-1-7株的 低神经毒力很不稳定而其余各株的弱毒特征很稳定.因此,E-176(Ile→Val),E-439(Lys→Arg)和 E-107(Leu→Phe)可能与神经外和神经内毒力减弱有关.E-138(Gul→Lys),E-315(Ala→Val)和 E-279(Lys→Met)的突变可能与神经毒力的减弱和稳定性相关.     

乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2全基因组序列测定及基因遗传稳定性

目的对乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株进行全基因组序列测定和分析,并观察该生产株在疫苗制备过程中的基因遗传稳定性。方法根据DNA序列数据库(Gen Bank)公布的SA14-14-2株的序列,设计合成7对引物,提取疫苗生产株SA14-14-2及其工作种子批生产的3批原液、3批成品疫苗的病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SA14-14-2株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至大肠埃希菌DH5α中,挑取阳性菌落克隆、鉴定后测定全序列并对序列进行比较分析,观察毒株在传代的过程中病毒滴度的稳定性。结果乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株基因组全长10 976 bp,编码3 433个氨基酸。3批原液和3批成品疫苗的基因组全长为10 977 bp,比较分析发现,在3'端非编码区10 701处多一个G核苷酸的插入。与DNA序列数据库(Genbank)登录号为D90195的全长序列同源性分别是99.9%、99.9%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%、99.8%,其中E蛋白的同源性均为100%。SA14-14-2生产株的病毒滴度为7.22 lg PFU/mL,原液和成品疫苗的滴度分别为7.32、7.23、7.32、6.86、6.92、6.70 lg PFU/mL。结论乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2基因稳定,具有良好的一致性,为乙型脑炎减毒活疫苗的质量的稳定性提供了可靠依据。     

流行性乙型脑炎强毒株和弱毒疫苗株SA14-14-2对猴子和小鼠的致病性和病理学研究

为了解乙型脑炎 (乙脑 )减毒活疫苗弱毒株SA14 14 2神经毒力的减弱程度 ,本文对弱毒株及其原株SA14强毒株进行了猴体和小白鼠的致病性和病理学变化的比较试验。SA14强毒株病毒 (原始滴度 6 15× 10 8/ml) ,以10 -2 和 10 -4 ～ 10 -7不同稀释度于丘脑两侧合并脊髓注射恒河猴 ,每组除 10 -4 1只外其余均为 2只。另以 10 -4 和10 -6～ 10 -8不同稀释度脑内注射小鼠 ,每组 8只。结果猴子除 10 -4 1只外其余全部发病死亡 ,小鼠则全部死亡。SA14 14 2以 1∶5稀释病毒 (原始滴度为 8× 10 6/ml)按同样方法注射 4只猴和 30只小鼠 ,结果全部存活。另以SA1410 -2 病毒皮下注射 3只猴未死亡 ,而以 10 -1皮下注射 30只小鼠时则全部死亡。SA14 14 2以 1∶5稀释病毒皮下注射小鼠时则全部存活。病理组织学结果显示二种动物接种SA14株强毒后主要表现为弥散性脑脊髓炎 ,以神经细胞坏死为其主要特征和最突出的病变。猴子的病变以脊髓前角、丘脑和中脑黑质为重 ,小鼠的病变则以大脑皮质、海马部最重 ,脊髓的病变却比脑轻。接种弱毒株的动物则仅有轻微炎症反应、神经细胞坏死极少出现。以上结果表明以脑内接种时恒河猴和小鼠对乙脑病毒均高度敏感 ,以皮下接种时小鼠的敏感性高于猴子。乙脑SA14 14 2弱毒株的神经毒力包括致     

一株强神经毒力乙脑病毒株的生物学及其分子特征

研究一株神经毒力很强的乙型脑炎病毒株SA4株的生物学特性并进行基因组全序列分析,并找到其毒力强的分子基础。将SA4脑内接种昆明小鼠后每日观察发病和死亡鼠数并每日收取鼠脑,用空斑法检测接种后不同时间点的脑内病毒增殖滴度,同时以另一株乙脑病毒SA14按照相同方法进行平行实验作为对照。SA4株的全基因组测序序列结果与乙脑SA14株及世界各地共21株乙脑病毒的全基因组序列进行比较。结果显示,脑内接种SA4株的小鼠发病和死亡时间均比SA14株早1d,在相同时间点上SA4株的病毒滴度高0.5～1.0lgPFU/mL。SA4株与世界各地毒株基因同源性比对,核苷酸同源性为84.6%～99.0%,氨基酸同源性为95.2%～99.7%。与SA14相比,氨基酸序列存在17个位点的差异,分布于不同的区段,其中E区最多,为5个。证明SA4是一株在脑内具有较快繁殖力的神经毒力很强的毒株,其序列上17个氨基酸位点的替换很可能是其强神经毒力的分子基础。     

陕西省9株乙脑病毒的分离及E基因序列分析

分析陕西省分离的9株乙脑病毒基因组序列特征。使用乙脑病毒全基因组序列测定引物进行RT-PCR扩增,扩增产物进行测序,拼接后获得基因组序列。利用MEGA 4.1、MegAlin、MEGA7.0等软件进行毒株的系统进化分析,并与P3株、减毒活疫苗SA14-14-2株及覆盖5个基因型别的其他乙脑病毒进行E基因序列比对。9株分离株3株分离自猪舍、6株分离自羊舍,其中4株获得全基因组序列,5株测得E基因序列。基于E基因序列进行毒株核苷酸、氨基酸同源性比较,结果显示分离株均与基因I型GI-b亚型毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性范围为96.5%～99.7%、氨基酸同源性范围99.2%～100.0%;与SA14-14-2株核苷酸同源性范围为87.5%～88.9%、氨基酸同源性范围96.3%～97.2%;与P3株核苷酸同源性范围为87.6%～88.1%、氨基酸同源性范围96.7%～97.6%。分析09年（陕南地区）分离株与18年（关中地区）分离株的E基因核苷酸差异率为1.8%～2.9%、氨基酸差异率为0%～0.8%。陕西省自然界中循环的乙脑病毒以基因Ⅰ型为主,与P3株在抗原毒力关键位点无差异,...     

乙型脑炎病毒野毒株及其不同株减毒株E蛋白基因序列比较

为了解乙脑减毒活疫苗株SA14 14 2的神经毒力减毒机制 ,用RT PCR方法分别扩增不同减毒程度毒株的E基因 ,克隆、测序 ,继而对各毒株序列进行比较。结果表明SA14 强毒株与SA14 12 1 7株间只有 3个氨基酸发生改变 (E 10 7,E 176 ,E 4 39) ,SA14 12 1 7与SA14 9 7和SA14 5 3株间有另 3个氨基酸发生改变 (E 138,E 2 79,E 315 )。SA14 9 7株与SA14 5 3株只有一个核苷酸NT 4 0 5不同 ,但未引起氨基酸改变。SA14 14 2疫苗株除保留SA14 12 1 7和SA14 9 7所改变的 6个氨基酸外 ,另有 2个氨基酸发生了改变 (E 177,E 2 6 4 ) ,共计在E区共发生 8个氨基酸的替代。SA14 12 1 7株的低神经毒力很不稳定而其余各株的弱毒特征很稳定。因此 ,E 176 (Ile→Val) ,E 4 39(Lys→Arg)和E 10 7(Leu→Phe)可能与神经外和神经内毒力减弱有关。E 138(Gul→Lys) ,E 315 (Ala→Val)和E 2 79(Lys→Met)的突变可能与神经毒力的减弱和稳定性相关     

乙型脑炎病毒NS1′蛋白表达对小鼠毒力的影响

为探究乙型脑炎病毒NS1′蛋白表达对小鼠神经毒力和神经侵袭力的影响，以乙脑病毒疫苗株SA14-14-2为模板，对NS2A基因进行A66G定点突变，并构建全长感染性克隆。体外转录后，将病毒RNA导入BHK21细胞，获得突变病毒SA14-14-2（A66G）。同样以乙脑病毒野毒株SA14为模板，采用相同方法构建并获得突变病毒SA14（G66A）。经测序和间接免疫荧光鉴定，证明突变病毒构建成功。Western blot检测发现疫苗株SA14-14-2和SA14(G66A)不表达NS1′蛋白，而野毒株SA14和SA14-14-2（A66G）能表达NS1′蛋白。生长曲线显示突变病毒的生长特性无明显改变。蚀斑实验发现SA14(G66A)的蚀斑较SA14更小，SA14-14-2(A66G)的蚀斑较SA14-14-2更大。细胞增殖活性实验显示NS1′蛋白表达对BHK21细胞的增殖有明显抑制作用 (P＜0.01)。疫苗株SA14-14-2与SA14-14-2（A66G）对1周龄小鼠脑内接种的LD50分别为297.9 PFU(0.02 mL)和143.4 PFU(0.02 mL)，野毒株SA14和SA14(G66A)对3周龄小鼠脑内接种的LD50分别为0.8 PFU(0.03 mL)和2.3 PFU(0.03 mL)。疫苗株SA14-14-2与SA14-14-2(A66G)对2周龄小鼠腹腔接种的LD50分别为＞5.65×10⁶ PFU(0.5 mL)和＞1.46×10⁶ PFU(0.5 mL)。野毒株SA14和SA14(G66A)对3周龄小鼠腹腔接种的LD50分别为1.3×10³ PFU (0.5 mL)和1.2×10⁴ PFU(0.5 mL)。结果表明，乙脑病毒NS2A中第66位碱基是影响NS1′蛋白表达与否的关键位点，且NS1′蛋白表达能提高病毒对小鼠的神经毒力与神经侵袭力，其中对侵袭力的影响更为显著。     

流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2弱毒株某些体外特征的研究

本文研究了流行性乙型脑炎病毒弱毒14-2株及5-3株的某些体外特征,发现:1.在地鼠肾细胞内弱毒株的病变较强毒株晚;在C6/36细胞内,弱毒株仅出现细胞圆缩、松散、脱落,而强毒株产生类似细胞融合型病变;在LLC-MK2和原代鸡胚细胞内,弱毒株出现模糊不清的针点状小蚀斑,而强毒株则出现清晰的3～5mm大蚀斑。2.在50℃加温条件下,14-2与SA14的热稳定性相同,但5-3的热稳定性明显地较差;两株弱毒株均能在40℃培养条件下繁殖良好,与37℃培养无明显差别,并均能在小鼠巨噬细胞内良好繁殖,但生长速度较强毒株慢,病变也较差。 本文并对弱毒株的免疫原性和ret及T50特征的关系进行了讨论。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2E基因的稳定性

分别对SA14-14-2(PHK8代)疫苗株及其原野毒株SA14和另2个疫苗传代株[SA14-14-2(PHK17代)和SA14-14-2(鼠脑1代)]的E区基因进行了序列测定.结果表明,乙脑病毒减毒活疫苗SA14-14-2在PHK细胞上连传至17代时,发现2个氨基酸突变(E-331、E-398),但不是回复突变.虽然在毒力最容易返祖的乳鼠脑内传1代后发生E-107个氨基酸回复,但与野毒株毒力相比仍然相差很大,无毒力返祖现象.在疫苗的实际质控工作中,对上述与毒力相关的基因进行监测,可能有助于发现减毒活疫苗的毒力水平,为疫苗安全性提供更可靠的检测手段.     

表达乙型脑炎病毒抗原的非复制型重组痘苗病毒能在小鼠中诱发免疫保护

使用2×107PFU乙脑病毒野毒株GSS抗原preM-E-NS1-NS2a的非复制型重组痘苗病毒NTV-JEV免疫3周龄BALB/c小鼠,小鼠体内乙脑病毒特异性抗体滴度1∶71,IgG2a/IgG1为1.5,中和抗体滴度为1∶8,免疫组小鼠产生特异性补体介导的细胞杀伤作用。以10 LD50乙脑P3株病毒对小鼠进行了脑内攻击,NTV-JEV免疫组小鼠存活率为100%,与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2免疫组存活率相同。100 LD50P3株病毒攻击后NTV-JEV免疫组存活率28.6%,与SA14-14-2组免疫效果无明显差别。存活小鼠体内乙脑病毒特异性抗体升高为1∶179,IgG2a/IgG1比值为1.9,中和抗体大于1∶16。以30 LD50GSS株病毒进行攻击后,NTV-JEV免疫组和SA14-14-2组保护率均为8.3%。上述结果表明,NTV-JEV与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2株具有相近的保护力,NTV-JEV不仅可以保护小鼠抵抗同株病毒GSS的攻击,而且可以抵抗异株病毒P3的攻击。     

利用流行性乙型脑炎病毒减毒株脑细胞吸附特征快速筛选减毒株的初步研究

实验证明,流行性乙型脑炎病毒减毒株的脑细胞吸附能力明显低于强毒株。据此,我们发展建立了一种从强毒SA14株中快速、简便地筛选减毒株的新方法。将3周鼠脑细胞37℃吸附SA14株1小时,从未吸附的病毒颗粒中挑出3个减毒株(C4、C5和B1)。将C5株再次吸附筛选,得到C563株。C563株已完全丧失对3周鼠的脑内毒力和皮下毒力,免疫小鼠一针即能诱导良好的抗体反应和保护力,经BHK21细胞盲传5代或乳鼠脑传一代,毒力没有明显回升。     

乙型脑炎单克隆抗体羊血球结合物的被动凝集和被动凝集抑制试验在乙型脑炎诊断中的应用

实验比较了所获得的5株乙脑单克隆抗体(McAb)与经戊二醛和甲醛处理的羊血球的结合能力,证实5株中以I_4McAb(IgM亚类)较好。 以乙脑单克隆抗体羊血球结合物(简称McAb-血球)的被动凝集试验(RPHA),检测乙脑病毒的不同毒株及同类的其它病毒,结果McAb-血球能和A2、SA14、高顺生、P3和中山株发生良好的凝集反     

柔嫩艾美耳球虫地克株利抗药株与敏感株孢子化卵囊的蛋白质差异分析

利用双向电泳技术,对本实验室诱导保存的柔嫩艾美耳球虫地克株利抗药株与敏感株的蛋白质表达图谱进行差异比较和分析,发现两者之间差异有5个蛋白质斑点,利用MALDI_TOF_TOF质谱技术对其中4个差异明显的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得4个明确的肽质量指纹图谱,通过在NCBInr数据库中检索分析,确定了其中2个蛋白质分别为球虫子孢子表面抗原TA4和热休克蛋白Hsp70 ,另外两种为真核细胞的功能蛋白。上述蛋白的鉴定将对球虫的抗药性产生机理和柔嫩艾美耳球虫地克株利抗药株的分子标志物提供了研究方向。