重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达

Mabinlin Ⅱ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白,在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物.本文根据已知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆Mabinlin Ⅱ基因,对基因进行剪切重组.将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,构建了3个重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌.经IPTG诱导,3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

马槟榔甜蛋白基因(MBLⅡ)的拼接与表达载体的构建

从云南植物Capparismasaikai中提取总DNA,设计引物克隆马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ,序列测定后经同源性分析表明与GeneBank中登陆的马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ(cDNA)序列一致,表明MBLⅡ不存在内含子序列。利用重叠区扩增基因拼接法(genesplicingbyoverlapextension,geneSOEing)进行体外基因剪接,剪接片段与植物表达载体pVKH相连,构建pVKH-35S-MBLⅡ-Pa、pVKH-35S-S-A B-pA、pVKH-35S-A B-pA、pVKH-35S-S-A-pA、pVKH-35S-S-B-pA,为寻找mabinlin的活性表达形式和翻译后剪接机制打下基础。     

外源甜蛋白thaumatin II基因转入烟草的研究

利用土壤农杆菌系统,将高甜度的外源甜蛋白thaumatin II基因转入烟草细胞,并得到大量转基因植株及其后代。经分子杂交分析确证thaumatin II基因已整合到烟草植株的基因组中,并在转录水平检测到表达。标记基因胭脂碱合成酶(NOS)基因及新霉素磷酸转移酶(NPT II)基因也在转基因植株中正常表达。     

川滇高山栎QaGDU3基因的克隆及遗传转化

以川滇高山栎(Quercus aquifolioides Rehd. et Wils.)叶片为材料,分别采用不依赖于连接反应的克隆法、农杆菌花序侵染、实时荧光定量PCR、图像分析等方法克隆了QaGDU3基因,获得QaGDU3转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)并分析转基因植物的表型变化,利用生物信息学对QaGDU3蛋白与其他物种的GDU3蛋白序列间的差异和进化关系进行了分析。结果显示,GDU3是种子植物特有的基因;QaGDU3属于阴离子渗透酶ArsB/NhaD超家族成员,可能具有氨基酸转运功能。QaGDU3基因在拟南芥中过表达能够激活水杨酸(SA)途径中AtPR1、AtACD6、AtCBP60g和AtPAD4基因的表达,且转基因拟南芥莲座大小随着QaGDU3基因表达量升高而变小。研究结果说明GDU3是种子植物所特有的氨基酸转运蛋白并参与植物生长发育的调控。     

奇甜蛋白基因在园艺作物中的表达

奇甜蛋白（thaumatin）是从非洲西部植物katemfe（Thaumatococcus daniellii Benth）中提取得到的几种关系相近的甜味蛋白的统称,其中最主要的为奇甜蛋白Ⅰ和奇甜蛋白Ⅱ。奇甜蛋白不仅甜度高,而且具有低热量、安全无毒以及不易诱发糖尿病等优点。因此,将奇甜蛋白基因转入园艺作物中并使之表达,用以提高可食部分的甜味,有其特别的研究意义。奇甜蛋白基因已先后在马铃薯、梨树、黄瓜、番茄等园艺作物得到表达,但仍有一些问题需要解决。现从奇甜蛋白基因的克隆、测序与表达,转基因果实的安全性检测,甜度的感官评价,甜味遗传特点以及奇甜蛋白抗真菌病害检验等几个方面综述了国内外研究进展,并对今后的研究提出了建议。     

单链莫内甜蛋白基因的合成及其植物表达载体的构建

目的:合成单链莫内甜蛋白基因,构建其植物表达载体。方法与结果:根据已报道的单链莫内甜蛋白的氨基酸序列及甜味机理,重新设计合成了全长294bp的莫内甜蛋白基因,其中单链莫内甜蛋白氨基酸序列中的Asp69(原AspA16)突变为Asn。利用DNA重组技术,将莫内甜蛋白基因克隆到植物表达载体pBl221中,构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体pBI221-monellin。结论:构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体,为转化园艺植物以改善其口感奠定了基础。     

拟南芥AtVQ29基因的克隆与植物表达载体构建

目的:VQ模序蛋白是植物中所特有的一类具有高度保守序列的蛋白质,广泛参与植物的生长发育与逆境反应,本研究拟克隆拟南芥的AtVQ29基因并进一步构建由组成型启动子CaMV 35S驱动的植物表达载体pSN1301-AtVQ29。方法:采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,根据已报道的AtVQ29基因序列设计并合成引物,通过PCR技术扩增获得拟南芥AtVQ29基因,经T载体克隆后测序。利用生物信息学软件对序列进行初步分析,同时基于基因重组技术构建植物表达载体。结果:序列分析表明已成功克隆AtVQ29基因,该基因编码区全长为372bp,共编码123个氨基酸残基,具有保守的VQ模序。并进一步构建了由组成型启动子CaMV 35S驱动的AtVQ29基因植物表达载体pSN1301-AtVQ29。结论:本研究所构建的AtVQ29基因植物表达载体能够在转基因植株中过量表达AtVQ29基因,为后期开展基因功能研究与植物基因改良奠定了基础。     

甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化

以5～7d龄的“丽春”番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg／L。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLⅡ基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组。     

普通烟草NtODB基因的电子克隆、表达及生物信息学分析

ODB基因在植物同源重组依赖性的DNA双键断裂修复过程中起重要作用,对植物诱变育种具有潜在的应用价值。克隆烟草NtODB基因并分析其表达特征为丰富ODB基因在同源重组DNA修复过程中的作用提供证据。为得到烟草NtODB基因序列,采用电子克隆技术获得该基因cDNA序列并克隆验证。进一步使用生物信息学方法分析该基因表达特征,对预测蛋白的理化性质、信号肽、高级结构等进行预测。生物信息学分析结果表明,NtODB基因开放阅读框包含579个碱基,蛋白含192个氨基酸残基,NtODB蛋白具有碱性和亲水性,主要定位于细胞质内;实时荧光定量PCR检测结果显示NtODB基因在不同组织中呈现组成型表达特征;亚细胞定位检测提示NtODB主要表达于细胞膜和叶绿体。NtODB基因的克隆与表达分析及其蛋白高级结构和理化性质的预测,可为进一步丰富ODB基因在同源重组依赖的DNA修复系统中的作用机制提供证据。     

番茄E8基因启动子的克隆及其在拟南芥中的表达

利用PCR技术从番茄基因组DNA中克隆长约1.1kb的E8基因启动子与517bp的E8基因片段,将其二者连接构建植物表达载体,导入农杆菌,通过花序侵染法转化拟南芥,得到转基因拟南芥。用RT-PCR分析转基因拟南芥中E8基因启动子驱动E8基因小片段的结果表明,E8基因小片段mRNA仅在转基因拟南芥长角果中转录,根、茎、叶、花中不转录,提示E8基因的1.1kb启动子在异源植物拟南芥中仍具有驱动外源基因果实特异性表达的特性。     

Expression of immunogenic VP2 protein of infectious bursal disease virus in Arabidopsis thaliana

VP2 protein is the major host-protective immunogen of infectious bursal disease virus (IBDV) of chickens. Transgenic lines of Arabidopsis thaliana expressing recombinant VP2 were developed. The VP2 gene of an IBDV antigenic variant E strain was isolated, amplified by RT-PCR and introduced into a plant expression vector, pE1857, having a strong promoter for plant expression. A resulting construct with a Bar gene cassette for bialaphos selection in plant (rpE-VP2) was introduced into Agrobacterium tumefaciens by electroporation. Agrobacterium containing the rpE-VP2 construct was used to transform Ar. thaliana and transgenic plants were selected using bialaphos. The presence of VP2 transgene in plants was confirmed by PCR and Southern blot analysis and its expression was confirmed by RT-PCR. Western blot analysis and antigen-capture ELISA assay using monoclonal anti-VP2 were used to determine the expression of VP2 protein in transgenic plants. The level of VP2 protein in the leaf extracts of selected transgenic plants varied from 0.5% to 4.8% of the total soluble protein. Recombinant VP2 protein produced in plants induced antibody response against IBDV in orally-fed chickens.     

Expression of a sweet cherry DREB1/CBF ortholog in Arabidopsis confers salt and freezing tolerance

Dehydration responsive element binding protein 1 (DREB1)/C-repeat binding factor (CBF) induces the expression of many stress-inducible genes in Arabidopsis. We have previously reported the identification of three DREB1/ICBF homologs from sweet cherry (Prunus avium). To identify the function of these homologs, one of the genes, CIG-B, was transformed into Arabidopsis. In one of the transgenic plant lines, the DREB1/CBF target gene cor15a was induced in the absence of stress treatment. The cor15a-overexpressing transgenic plant exhibited mild growth retardation and had greater salt and freezing tolerance than did the wild-type and the transgenic lines in which cor15a was not induced. These results suggest that this sweet cherry DREB1/CBF homolog has a function similar to that of DREB1/CBF.     

野生大豆盐碱胁迫相关GsTIFY11b的克隆与功能分析

以耐盐碱野生大豆(Glycine soja L.G07256)为材料, 采用同源克隆方法和RT-PCR技术获得一个TIFY 类基因的全长cDNA(命名为GsTIFY11b)。进化树分析表明, 与其他物种相比, GsTIFY11b与拟南芥的AtTIFY11a基因相似性最高, 达到56%; 序列分析表明GsTIFY11b蛋白除具有 TIFY保守结构域外, 还具有一个N端保守结构域和一个C端保守的Jas结构域; 实时荧光定量PCR结果显示该基因受盐和碱胁迫诱导表达; 将GsTIFY11b转化拟南芥来验证其耐盐碱功能, 获得两个转基因纯合体株系, 盐碱胁迫分析结果表明, GsTIFY11b的超量表达没能提高拟南芥对盐碱胁迫的耐性, 并且与野生型相比, 转基因植株在种子萌发期和苗期表现出对盐胁迫更加敏感。盐胁迫信号通路相关marker基因在转基因拟南芥中的表达特性分析表明, GsTIFY11b可以调控RD29B、KIN1、DREB等基因的转录。在洋葱表皮细胞中瞬时表达GsTIFY11b-GFP融合蛋白的结果表明, GsTIFY11b定位于细胞核中。上述结果表明, 该基因在细胞核中起着转录调节子的作用, 可能是通过调控盐胁迫信号通路中关键基因的表达来改变植物对盐胁迫的耐受性。     

野生大豆盐碱胁迫相关GsTIFY11b的克隆与功能分析

以耐盐碱野生大豆(Glycine soja L.G07256)为材料,采用同源克隆方法和RT-PCR技术获得一个TIFY类基因的全长cDNA(命名为GsTIFY11b)。进化树分析表明,与其他物种相比,GsTIFY11b与拟南芥的AtTIFY11a基因相似性最高,达到56%;序列分析表明GsTIFY11b蛋白除具有TIFY保守结构域外,还具有一个N端保守结构域和一个C端保守的Jas结构域;实时荧光定量PCR结果显示该基因受盐和碱胁迫诱导表达;将GsTIFY11b转化拟南芥来验证其耐盐碱功能,获得两个转基因纯合体株系,盐碱胁迫分析结果表明,GsTIFY11b的超量表达没能提高拟南芥对盐碱胁迫的耐性,并且与野生型相比,转基因植株在种子萌发期和苗期表现出对盐胁迫更加敏感。盐胁迫信号通路相关marker基因在转基因拟南芥中的表达特性分析表明,GsTIFY11b可以调控RD29B、KIN1、DREB等基因的转录。在洋葱表皮细胞中瞬时表达GsTIFY11b-GFP融合蛋白的结果表明,GsTIFY11b定位于细胞核中。上述结果表明,该基因在细胞核中起着转录调节子的作用,可能是通过调控盐胁迫信号通路中关键基因的表达来改变植物对盐胁迫的耐受性。     

亲环素AtCYP1 RNA干涉载体的构建及对拟南芥发育的影响

根据拟南芥AtCYP1基因序列设计特异引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtCYP1基因中344 bp转录本,插入表达载体PTCK303,构建目的基因RNA干扰载体Ubi::AtCYP1i。利用改良的农杆菌浸染技术获得拟南芥RNAi转基因株系,RT-PCR分析结果表明转基因株系中AtCYP1基因的表达量低于野生型,表型观察结果表明RNAi转基因纯合株系抽苔时间比野生型晚3.32 d,抽苔叶片数较野生型多2.49片,其开花时间、结出第一个种荚的时间、株高等方面也与野生型存在明显差异。此结果说明AtCYP1可能参与了拟南芥的早花发育过程,为进一步研究其在植物生长发育中的功能奠定了基础。     

大豆油体与EGF融合基因的克隆及其在红花种子中的表达

目的：旨在建立一种在红花油体中表达EGF的转基因植物的方法。方法：通过PCR技术把大豆油体基因（DDoil）与EGF构建成融合基因,克隆至植物表达载体pCAMBIA1390R中,构建成植物表达载体p1390Do-EGF,然后转化进农杆菌 LBA4404 中用于侵染红花外植体,通过甘露糖筛选培养基培养可获得红花转化苗。通过PCR、实时荧光相对定量RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot分析目的基因的表达情况,通过MTT法检测EGF的促细胞增殖活性。结果：PCR结果显示,红花叶片中能检测到EGF基因;实时荧光相对定量RT-PCR结果显示,在红花种子中EGF能成功实现转录;SDS-PAGE和Western blot检测证明,在转基因红花种子中能有效表达出EGF,并具有其原有的免疫原性,MTT法实验结果表明EGF具有促进balb/c 3T3细胞增殖的生物活性。结论：大豆油体和EGF融合基因已经成功转化进红花细胞的基因组中,并实现了EGF外源蛋白在红花种子油体中的表达,为EGF蛋白的产业化生产探讨了一种新的生产途径。     

Ectopic expression of an Arabidopsis single zinc finger gene in tobacco results in dwarf plants

A survey of the Arabidopsis thaliana databases revealed that single C2H2 zinc finger protein genes comprise a large gene family (approximately 30 genes). No known phenotype has been associated with any of these genes except SUPERMAN. One of these genes, designated AtZFP10 (A. thaliana single zinc finger protein), was isolated by RT-PCR in the present study. The AtZFP10 gene was expressed at low levels in the flowers, axillary meristems and siliques, and at very low levels in the stems in Arabidopsis. Overexpression of the AtZFP10 gene driven by a constitutive promoter resulted in abnormal Arabidopsis plants and only one plant was recovered. Tobacco plants overexpressing the AtZFP10 gene displayed dwarfing, abnormal leaf phenotypes and early flowering that correlated with the level of expression of the AtZFP10 gene. No differences were observed in cell size between the AtZFP10 transgenic plants and the wild-type plants. Application of exogenous GA3 did not restore the wild-type phenotype, but it did reduce the dwarfing phenotype. Deletion of the leucine-rich region at the carboxyl terminus of the AtZFP10 gene resulted in transgenic plants that were not phenotypically different from wild-type plants suggesting a role for the leucine-rich region as essential for normal function.     

灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因（CgVP1）过表达提高拟南芥的耐盐性。

克隆获得包含完整开放阅读框（0RF）的灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因（CgVP1）cDNA序列,构建成基因表达载体pCAMBIA1301．1-CgVPl后,利用根癌农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,再以抗性筛选方法获得了T3代纯合的转基因植株,经检测外源目的基因已经整合到拟南芥基因组中并能正常表达。分析结果表明,在拟南芥中过表达劬VP1基因后提高了植株抗盐胁迫的能力。     

过量表达棉花CBF2基因提高转基因拟南芥抗旱耐盐能力

CBF/DREB是一类植物中特有的转录因子,在植物抵抗逆境胁迫过程中发挥重要功能。本研究从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)Coker 312中克隆获得1个棉花CBF/DREB基因,命名为Gh CBF2,该基因编码一个由216个氨基酸组成的CBF蛋白。序列分析结果显示,Gh CBF2与其他植物的CBF蛋白类似,含有AP2转录因子典型的保守结构域。干旱或高盐胁迫处理明显增加了Gh CBF2基因的表达量。亚细胞定位分析结果发现Gh CBF2定位在细胞核中。将Gh CBF2基因构建到由35S启动子调控的植物表达载体p MD上并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),结果表明,在干旱和盐胁迫条件下,过量表达Gh CBF2基因拟南芥的成活率显著高于野生型,并且游离脯氨酸和可溶性糖含量也高于野生型,说明转Gh CBF2基因提高了拟南芥的耐盐抗旱能力。采用实时荧光定量PCR方法分析胁迫相关标记基因COR15A、RD29A和ERD6的表达情况,结果显示转基因株系中的表达量显著高于野生型,说明Gh CBF2参与调控拟南芥干旱和盐胁迫相关基因的表达。