马槟榔甜蛋白基因（MBL11）的剪切重组和结构分析

马槟榔甜蛋白（mabinlin II）是我国所特有且唯一的植物甜蛋白,在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物。本文采用基因工程手段对基因进行剪切重组,将重组基因构建成植物表达载体转入拟南芥中,通过RT-．PCR检测导入基因的表达,同时采用生物信息学方法对MBL II基因及其重组基因进行分析和甜味检测显示,转基因拟南芥不具有明显的甜味,但RT-PCR的结果显示,MBL II基因及其重组基因可在转基因的拟南芥中表达。根据生物信息学方法分析结果推测,导入拟南芥中的重组马槟榔甜蛋白可能是具有甜味的蛋白。     

重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达

Mabinlin Ⅱ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白,在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物.本文根据已知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆Mabinlin Ⅱ基因,对基因进行剪切重组.将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,构建了3个重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌.经IPTG诱导,3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化

以5～7d龄的“丽春”番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg／L。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLⅡ基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组。     

与拟南芥抗寒性相关的CBF3和AtGolS3基因克隆及其表达载体的构建

用RT—PCR技术从拟南芥（Arabidopsis thaliana）克隆到抗寒相关基因CBF3,AtGoIS3,序列分析后用BLAST软件作同源序列分析的结果显示,它们的核苷酸序列与GenBank中登录的拟南芥CBF3（AF074602）,AtGoIS3（AB062850）核苷酸序列完全相同。CBF3丹和AfGoIS3基因分别与植物表达载体pVKH相连构建pVKH-35S-CBF3-pA、pVKH．35S-AtGolS3．pA以及通过中间载体pRT101,将AtGolS3连接到pVKH-35S-CBF3-pA上,成为各自带有35S启动子及PolyA终止子的双价植物表达载体pVKH一35S—CBF3-pA-35S-AtGolS3-pA。     

单链莫内甜蛋白基因的合成及其植物表达载体的构建

目的:合成单链莫内甜蛋白基因,构建其植物表达载体。方法与结果:根据已报道的单链莫内甜蛋白的氨基酸序列及甜味机理,重新设计合成了全长294bp的莫内甜蛋白基因,其中单链莫内甜蛋白氨基酸序列中的Asp69(原AspA16)突变为Asn。利用DNA重组技术,将莫内甜蛋白基因克隆到植物表达载体pBl221中,构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体pBI221-monellin。结论:构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体,为转化园艺植物以改善其口感奠定了基础。     

拟南芥中与植物生长和耐寒相关的miRNA表达载体的构建

本研究通过PCR方法从拟南芥基因组序列中分离了3个理论推断与耐寒相关的miRNA片段(miRNA402,miRNA319和miRNA393)和1个与植物生长相关的片段miRNA172。利用重叠延伸PCR技术将miRNA172小分子,以及3个与耐寒相关的miRNA402,miRNA319和miRNA393小分子串连在一起分别导入植物表达载体pVKH-35S-GUS-pA,取代表达载体中的GUS基因,构建了pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir31+402+393-pA融合表达载体。经PCR和双酶切及测序鉴定,pVKH-35S-mir172-pA和pVKH-35S-mir319+402+393-pA构建成功,为后续利用基因工程手段,miRNA转化木薯,提高木薯生长和木薯耐寒相关研究奠定基础。     

烟草花叶病毒外壳蛋白嵌合基团的重组

普通烟草花叶病毒外壳蛋白基因已和花椰菜花叶病毒35S启动子及3′未端重组成嵌合基因。在连接了用于筛选在土壤杆菌中导入外源基因的新霉素磷酸转移酶Ⅰ(NPT Ⅰ)基因和用于筛选在植物细胞中导入外源基因的嵌合的新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT Ⅱ)基因后,已导入一个去致瘤基因的Ti载体T-DNA区中。这种在Ti载体T-DNA区带嵌合的烟草花叶病毒外壳蛋白基因的土壤杆菌菌株,可以用来转化植物。观察在转化植物中表达的这种外壳蛋白能否延缓或减轻烟草花叶病毒对它们的危害。     

用重叠PCR合成植物甜蛋白brazzein基因

目的:为在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中进行表达,采用重叠PCR合成了植物甜蛋白brazzein基因。方法:根据非洲热带植物Pentadiplandra brazzeana产生的天然甜蛋白brazzein的氨基酸序列及泡盛曲霉糖化酶基因glaA的密码子偏爱性,设计并化学合成了2对3’-端互补的寡聚核苷酸,通过PCR延伸获得2条末端有部分重叠的双链核苷酸片段,再通过重叠PCR扩增,合成了用于泡盛曲霉表达的植物甜蛋白brazzein基因。结果:将brazzein基因克隆到pMD18-T载体,随机挑取6个重组质粒测序,结果1个重组质粒有连续4个碱基缺失,3个重组质粒各有1个碱基缺失,2个重组质粒携带的brazzein基因核苷酸序列完全正确。结论:合成的brazzein基因大小162 bp,编码54个氨基酸,推断的氨基酸序列与Pentadiplandra brazzeana产生的天然brazzein完全一致,表明植物甜蛋白brazzein基因成功合成。     

马链球菌兽疫亚种类M蛋白的基因克隆、序列分析及其在猪源链球菌的检测

根据已发表的马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp .zooepidemicus)马源株的类M蛋白基因序列 ,设计和合成一对引物 ,以兽疫亚种猪源ATCC35 2 4 6株的基因组DNA为模板 ,通过PCR技术 ,扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET_32a( )中 ,测定其序列 ,GenBank接收号为AY2 6 3781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框 ,全长为 1137bp ,编码 379个氨基酸残基。经DNAStar软件分析 ,ATCC35 2 4 6株类M蛋白基因与兽疫亚种马源W6 0株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为 86 9%、30 8%、2 9 4 % ;推导的氨基酸序列的同源性分别为 84 3%、2 1 9%、2 3 4 %。但ATCC35 2 4 6株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验 ,检测 34株猪源链球菌类M蛋白基因 ,发现所有 16株C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因 ,而所有猪链球菌 (Streptococcussuis) 1型和 2型菌株及S群、B群、D群链球菌共 13株均不能检出类M蛋白基因 ,而 5株未鉴定的猪源链球菌中 3株能检测出类M基因。     

马槟榔甜味蛋白的研究——Ⅰ.提取、纯化和某些特性

从中药马槟榔(Capparis masaikai Levl.)成熟种子中分离了一种能引起持久甜味的蛋白质,取名为马槟榔甜蛋白(Mabinlin),分子量11,700,等电点pH11.8,在280nm波长有最大吸收峰,其引起甜味感觉的最低浓度为0.1％,种仁含甜蛋白量约4％。     

马槟榔DNA提取及其RAPD反应体系的优化

马槟榔是我国特有的仅分布在热带、亚热带地区的珍稀濒危野生果树,马槟榔种子中所富含的植物甜蛋白马宾灵(Mabinlin)在食品甜味剂领域有着广阔的应用前景.为了对我国马槟榔野生种质资源进行遗传多样性分析,本研究建立并优化了马槟榔基因组DNA的RAPD技术最优反应体系.结果表明,采用SDS-CTAB方法提取的马槟榔基因组DNA满足RAPD试验要求;RAPD最优反应体系(25 μL)为:引物的终浓度为1.0 μmol/L,dNTPs的终浓度为0.2 mmol/L,模板DNA的终浓度为1 600 ng/L,Taq DNA聚合酶用量为40 U/L.本研究通过对马槟榔DNA的提取及RAPD反应体系的优化,旨在为下一步对我国马槟榔野生种质资源进行遗传多样性分析提供基础.     

sgna基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因sgna的现有载体进行了改造,并引入筛选标记基因bar;为提高目的基因的表达水平,在目的基因5′端引入了Ω和kozak序列,3′端引入了poly(A)序列,成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4AGBar和pGBIU4AGBar,基因pGU4AGBar含有顺向连接的Ubi-sgna及Ubi-bar基因表达盒,pGBIU4AGBar含有T-DNA边界序列,并在其左右边界中间插入了含有顺向连接的CaNV35S-nptⅡ,Ubi-sgna和Ubi-bar基因表达盒,人工合成的雪花莲外源凝集素基因sgna可以编码对同翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

含融合杀虫基因和VHb基因双价表达载体的构建

目的：探索分子育种的新途径,获得高产多抗虫谱的转基因植物。方法：将密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（vgbM）基因与融合杀虫基因（GFMcryIA＋CPTI）构建成双价基因植物高效表达载体pGBI4ABCVHB,基因表达盒中含2个增强子、35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子以及正确切割、加工序列、Poly（A）信号序列。结果：通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株,结论：vgbM基因在转基因烟草中有效表达;融合杀虫基因也表达出活性毒蛋白。     

Tra2β1蛋白在神经特异性的基因剪接中的功能

体外(in vitro)生化研究已证明哺乳动物Tra2蛋白是前体mRNA剪接的重要调控因子,但是,对该蛋白在in vivo条件下的剪接功能,尤其是在神经特异性基因剪接中的功能及其细胞特异性,目前所知甚少。本文采用in vivo分析模型,在COS-1和PFSK两种不同类型的细胞中,研究了两个神经特异性基因(GluR-B,SMN2)剪接的细胞特异性,同时分析了Tra2β1在这两个基因剪接中的功能及其细胞特异性。结果表明,在研究的两种细胞中,GluR-B和SMN2“小基因”的剪接均具有明显的细胞特异性;而Tra2β1蛋白的过量表达在这两种不同的细胞中对“小基因”的剪接有显著的相同倾向的调节作用,提示Tra2β1蛋白对该两个基因剪接的调节作用可能没有细胞特异性。     

植物生长发育和逆境响应中SR-like蛋白的研究进展

同一基因pre-mRNA经可变剪接(alternative splicing, AS)后能够产生不同的转录本,使得编码的蛋白在细胞中的定位、稳定性和翻译后修饰的功能发生改变,进而增强应答发育及环境胁迫的能力,富含丝氨酸-精氨酸蛋白(serine/arginine-rich proteins, SR proteins/SR)是决定可变剪接效率和准确性的一个重要剪接因子家族。该文在简要介绍SR蛋白概念、分类的基础上,首次系统综述了植物特有的SR蛋白亚家族SR-like(SR45/45a)结构特点、成员构成、亚细胞定位和转录调控功能,尤其是对于非生物胁迫应答过程中相关基因可变剪接的调控机制进行了阐述,并展望了未来植物SR-like可能的前景方向和研究内容。     

雪里蕻非特异脂质转运蛋白基因的克隆与分析

非特异脂质转运蛋白是植物生命活动中一类重要的活性蛋白,这类蛋白在植物的抗性和防御中行使着重要的功能。近年来研究发现这类蛋白还与植物的有性生殖密切相关。通过已得到的普通白菜的脂质转运蛋白基因BcMF15的核苷酸序列,在其基因全长两侧设计引物,从雪里蕻中克隆得到该类活性蛋白基因,命名为BjLTP (登陆号: EU082009)。该基因全长650bp,不含内含子。不同组织的表达特征分析发现,BjLTP在雪里蕻的花蕾、开放的花中特异表达,推测BjLTP可能与花粉的发育有关。蛋白质特征预测及蛋白序列结构分析发现BjLTP是一个跨膜蛋白,具有显著的疏水区。序列同源比对表明该基因与白花芥蓝、拟南芥等的脂质转运蛋白基因有很高的相似性,证明BjLTP是LTP家族的成员之一。     

果蝇非经典剪接位点的生物信息学预测

目的:计算识别果蝇中新的非经典剪接位点,以探索未知的剪接机制。方法:基于黑腹果蝇表达序列标签(EST)与其基因组序列比对数据重构基因结构,从中发现非经典的剪接位点,并采用Weblogo软件分析非经典剪接位点上下游序列,以期发现剪接相关的特异性元件。结果:共得到265个非经典的剪接位点,这些剪接位点落在195个蛋白编码基因上。结论:应用生物信息学方法在果蝇中发现了上百个非经典剪接位点,为研究非经典剪接机制奠定了基础。     

马槟榔甜味蛋白的研究Ⅱ.甜蛋白Ⅱ和甜蛋白Ⅰ的比较

从马槟榔(Capparis masaikai Levl.)种子分离鉴定了二种甜蛋白:甜蛋白Ⅰ(mabinlinⅠ或MaⅠ)分子量MW11600,等电点pI 11.8;甜蛋白Ⅱ(mabinlinⅡ或MaⅡ)MW10400,pI 11.3。另一组分mabinlinⅢ MW10200,pI 11.8,可能是提取过程产物。MaⅡ有84个氨基酸残基,比MaⅠ少15个。它们有80个氨基酸残基是共同的,都是缺丝氨酸和蛋氨酸的单一多肽链。MaⅠ还缺赖氨酸和酪氨酸。测不出有自由SH基。在8M尿素中用巯基乙醇还原处理,两种甜蛋白分子都可转变为二聚体而失去甜味。 自去壳脱脂的种子干粉中提取MaⅠ和MaⅡ的得率依所用溶剂和提取条件而异。用50％丙酮水溶液提取,继用CM-纤维素分离,甜蛋白的得率达13％。用水或0.1N pH6.2磷酸缓冲液提取,得率低于1％。     

含VHb基因和GFMcryIA基因的双价基因植物高效表达载体的构建

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体PGBI4ASVHBBt,vgbM基因表达盒中含2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;Bt基因表达盒中,除含有以上提高转录和翻译的调控元件外,还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。利用根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株;PCR及Southern blot检测,证实了双价基因在烟草基因组中的整合;Western blot检测证实了vgbM基因在转基因烟草中的表达;杀虫实验表明GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。     

Tra2β1蛋白在神经特异性的基因剪接中的功能

体外(in vitro)生化研究已证明哺乳动物Tra2蛋白是前体mRNA剪接的重要调控因子,但是,对该蛋白在in vivo条件下的剪接功能,尤其是在神经特异性基因剪接中的功能及其细胞特异性,目前所知甚少。本文采用in vivo分析模型,在COS-l和PFSK两种不同类型的细胞中,研究了两个神经特异性基因(GluR-B,SMN2)剪接的细胞特异性,同时分析了Tra2β1在这两个基因剪接中的功能及其细胞特异性。结果表明,在研究的两种细胞中,GluR-B和SMN2“小基因”的剪接均具有明显的细胞特异性;而Tra2β1蛋白的过量表达在这两种不同的细胞中对“小基因”的剪接有显著的相同倾向的调节作用,提示Tra2β1蛋白对该两个基因剪接的调节作用可能没有细胞特异性。