紫外辐照恢复早期耐辐射奇球菌的转录组学分析（英文）

目的 耐辐射奇球菌是一种对紫外线、电离、干燥和化学试剂具有较强抗性的极端微生物。然而，该菌在紫外辐照后恢复早期的分子响应还不完全清楚。本文的目的是揭示耐辐射奇球菌在这一阶段的转录组响应。方法 本研究采用RNA-seq技术，测定了正常和紫外辐照培养条件下耐辐射奇球菌的转录组。为确定关键的差异表达基因及其调控关系，进行了功能富集分析。选取部分关键差异表达基因，进行实时定量PCR实验验证。利用以往研究中的转录组数据，寻找紫外辐照、电离辐射和干燥胁迫条件下公共的差异表达基因。构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络；对蛋白质互作网络中的枢纽基因和主要模块进行了鉴定；对这些枢纽基因和模块进行了功能富集分析。结果 紫外辐照后的恢复早期，上调基因数量是下调基因数量的2倍以上，且多数与应激反应和DNA修复有关。恢复早期的修复途径主要有单链退火（SSA）途径（涉及基因：ddr A-D）、非同源端连接（NHEJ）途径（涉及基因：lig B、ppr A）和核苷酸切除修复（NER）途径（涉及基因：uvr A-C），前两种途径为同源重组（HR）做准备，而NER途径去除紫外线照射带来的嘧啶二聚体。通过比较紫外辐照、电离辐...     

耐辐射球菌DNA双链断裂修复机制研究新进展

耐辐射球菌对于电离辐射等DNA损伤剂具有极强的抗性,能够将同一个基因组中同时产生的高达100个以上的DNA双链断裂在数十小时内高效而精准地进行修复,是研究DNA双链断裂修复机制的重要模式生物。同源重组、非同源末端连接和单链退火途径作为3个主要的修复途径参与了耐辐射球菌基因组DNA双链断裂的修复过程。此外,一系列新发现的重要蛋白质,如Ppr I、Ddr B等对于耐辐射球菌基因组的修复过程同样至关重要。根据本实验室和国内外在这一研究领域近年来的报道,以不同的修复途径为线索,综述该菌DNA双链断裂修复机制的最新研究成果。     

喜温嗜酸硫杆菌SM-1的ROS防护机制

【目的】从基因组水平探讨生物冶金微生物——喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)的活性氧类物质(Reactive oxygen species,ROS)防护机制。【方法】采用罗氏454 GS FLX测序平台对喜温嗜酸硫杆菌SM-1进行全基因组测序,利用NCBI非冗余蛋白数据库、Uniport蛋白数据库对全基因组序列进行功能注释,并采用基因组百科全书数据库(KEGG)进行基因组代谢途径重构,通过比较基因组学方法分析SM-1基因组中参与ROS防护相关的基因及可能的分子机制。【结果】SM-1细胞内的酶促抗氧化系统可用于清除细胞内产生的ROS物质,而非酶促抗氧化系统可用于维持细胞内的还原性内环境;细胞内的DNA损伤修复系统可用于修复DNA的氧化损伤从而保持个体遗传物质的稳定性。此外,SM-1基因组中大量的转座元件可能会增加基因组的可塑性以适应极端冶金环境。【结论】SM-1基因组序列的获得为从整体水平揭示喜温嗜酸硫杆菌适应生物冶金环境ROS氧化损伤的防护机制提供了帮助,对于SM-1的ROS防护机制的认知也为进一步通过遗传改造、提升其在高浓度重金属离子冶金环境中的抗性、提高冶金效率提供了理论指导。     

过氧化氢酶在豌豆蚜抵御藤黄微球菌和大肠杆菌感染引起的氧化胁迫中的作用

【目的】研究细菌-过氧化氢酶-豌豆蚜Acyrthosiphon pisum三者之间的关系,探索过氧化氢酶在豌豆蚜免疫防御反应中的作用。【方法】用体外培养结合菌落计数的方法检测藤黄微球菌Micrococcus luteus和大肠杆菌Escherichia coli感染豌豆蚜后在蚜虫体内的增殖;分别用微孔板荧光检测和实时定量PCR的方法检测藤黄微球菌和大肠杆菌感染豌豆蚜之后,蚜虫体内H_2O_2水平和过氧化氢酶基因的转录水平;通过RNA干扰技术对豌豆蚜过氧化氢酶基因(Cat)进行沉默,并检测沉默后感染藤黄微球菌和大肠杆菌的豌豆蚜体内H_2O_2浓度和细菌数目以及豌豆蚜存活率。【结果】藤黄微球菌感染12 h后,豌豆蚜体内H_2O_2水平以及过氧化氢酶基因表达水平显著升高;大肠杆菌感染12 h后,豌豆蚜过氧化氢酶基因表达水平上升,但H_2O_2水平无明显变化。沉默过氧化氢酶基因后,感染藤黄微球菌导致豌豆蚜体内H_2O_2含量在12 h显著上升,细菌数目在24 h约为对照组的一半,但对豌豆蚜存活率无影响;而过氧化氢酶基因沉默并未引起感染大肠杆菌的豌豆蚜体内H_2O_2水平、细菌数目以及豌豆蚜存活率发生明显变化。【结论】过氧化氢酶参与豌豆蚜对藤黄微球菌的防御过程,但不是该防御反应过程中的关键酶;而针对大肠杆菌感染,豌豆蚜可能通过其他途径来应对。     

极端嗜热古菌DNA修复核酸内切酶的研究进展

极端嗜热古菌由于生活在高温环境,其基因组DNA面临着严重的挑战,因此,它们如何维持其基因组稳定是本研究领域最为关注的科学问题之一。极端嗜热古菌具有与常温微生物相似的自发突变频率,暗示着它们比常温微生物具有更加有效的DNA修复体系进行修复高温所造成的基因组DNA损伤。目前,极端嗜热古菌DNA修复的分子机制尚不清楚。核酸内切酶在DNA修复途径中发挥着重要的作用。基因组序列显示极端嗜热古菌编码多种DNA修复核酸内切酶,但是其研究尚处于初期阶段。本文综述了极端嗜热古菌DNA修复核酸内切酶Nuc S、Endo V、Endo Q、XPF和Hjc的研究进展,并对今后的研究提出了展望。     

喜温嗜酸硫杆菌SM-1在不同温度下基因组的可塑性

【目的】驯化得到喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)SM-1在低于最适生长温度下具有较高生长活力的突变菌株,并认知喜温嗜酸硫杆菌在不同温度下的基因组可塑性。【方法】利用实验室长期进化实验对菌株进行3个温度的驯化:37、40、45°C。运用454测序技术对驯化获得的菌株进行基因组重测序,通过比较基因组分析驯化株基因组单核苷酸位点变化(SNPs),对包含位点变化的基因从功能上进行分类,在此基础上,分析可能与温度适应性相关的基因。【结果】通过不同温度下的长期驯化,得到了在低于最适生长温度下具有较高活力的菌株;重测序结果发现,SM-1基因组具有较好的可塑性,不同温度(37、40、45°C)生长的菌株中,基因组中分别有418、384和347个核苷酸位点发生累计变化,其中3个温度下有20个相同的非同义突变位点,分别分布于编码重金属和毒性抗性系统、DNA甲基化和蛋白乙酰化酶、核酸代谢相关酶类等相关基因上;相比而言,在低于最适生长温度(37、40°C)下生长菌株特有的位点变化涉及能量代谢、信号转导以及DNA/RNA稳定性相关基因;其中,2个低温菌株共同发生位点变化的基因有3个,其中两个编码转座相关的蛋白Atc_1031与Atc_1623,另一个编码假想蛋白Atc_1130,该蛋白分别与外膜蛋白组装因子B和二硫键形成蛋白具有23%和35%的相似性。另外,不同生长温度下相关蛋白中氨基酸的组成也发生变化。【结论】喜温嗜酸硫杆菌SM-1基因组具有较好的可塑性,对于其基因组变化的研究结果为认识微生物温度适应性提供了组学数据。本研究揭示喜温嗜酸硫杆菌(At.caldus)SM-1可能通过多种途径适应向低温过渡生长,既包括微生物通用的环境适应机制,也存在菌株特有的温度适应途径。     

外源糖原调控猪链球菌基因表达的转录组分析

【背景】碳水化合物的利用与猪链球菌在宿主体内的定殖和致病性密切相关。感染期间,宿主细胞释放的糖原可能是猪链球菌重要的碳源。【目的】从转录组学角度解析猪链球菌全基因转录水平对外源糖原诱导的响应,特别是毒力基因。【方法】将猪链球菌2型强毒株分别用糖原和葡萄糖进行液体培养,通过高通量转录组测序,比较分析糖原对猪链球菌代谢通路和毒力基因差异表达的影响,并通过体外试验和攻毒试验进行验证。【结果】猪链球菌在糖原培养基中生长良好。转录组数据显示,糖原培养条件下的猪链球菌共有908个基因差异表达,基因组占比46.07%,其中501个基因上调表达,407个基因下调表达。富集分析结果表明,糖原影响了猪链球菌广泛的基础代谢过程,但糖酵解途径保持稳定。30个毒力基因的表达水平发生变化,重要的毒力因子SLY、ApuA、ArcABC等的基因转录水平大幅度升高(倍数>20)。糖原培养后的猪链球菌的溶血活性、黏附和侵入能力显著上升,对受试动物的毒力增强,证实猪链球菌能够响应糖原诱导,糖原能调控猪链球菌的致病性。【结论】外源糖原的利用显著影响了猪链球菌的基因表达谱,这种对碳源的响应是细菌对不断变化的生存环境的适应...     

青藏高原阿里、那曲和海西地区土壤可培养放线菌的多样性

【目的】为了研究青藏高原北部地区土壤可培养放线菌的多样性,并比较不同选择性分离培养基对高原土壤放线菌的分离效果。【方法】使用9种分离培养基,并尝试添加藤黄微球菌发酵液,对采集自阿里、那曲和海西地区的14份土壤样品中的放线菌进行选择性分离。通过16S r RNA基因序列分析对分离菌株进行初步分类鉴定,并在不同分类水平上统计所分离得到的放线菌多样性。【结果】分离得到去重复后的放线菌255株,分布于放线菌门的8个目,14个科,23个属,包含94个可能的物种。其中至少25个物种可能为新种,分布于13个属。链霉菌属的菌株108株,可能的物种28个,是最主要的优势菌属。分离培养基中添加藤黄微球菌发酵液明显增加了放线菌分离菌株的数量和多样性,稀释的葡萄糖酵母麦芽汁培养基适合分离链霉菌,淀粉甘油脯氨酸培养基、丙酸钠酪蛋白培养基等则适合分离稀有放线菌。【结论】青藏高原北部土壤放线菌多样性非常丰富,并且存在较多的新颖放线菌类群;添加藤黄微球菌发酵液是提高放线菌分离效率的有效手段。     

精氨酸代谢途径抗酸关键基因对乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000胁迫抗性的影响

【目的】寻找精氨酸代谢途径中与酸胁迫相关的关键作用因素。【方法】通过在Lactococcus lactis NZ9000中分别过量表达来源于Lactobacillus casei Zhang的精氨酰琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酰琥珀酸裂解酶(ASL)改变精氨酸代谢提高酸胁迫抗性。【结果】与对照菌株对比,重组菌株在环境胁迫下表现了较高的生长性能、存活率和发酵性能。生理学分析发现,酸胁迫环境下,重组菌株细胞有较高的胞内NH4+、ATP含量和H+-ATPase活性,并显著提高了精氨酸脱亚胺酶(ADI)途径中的氨基酸浓度。进一步的转录分析发现,天冬氨酸合成、精氨酸代谢相关的基因转录水平上调。【结论】在L.lactis NZ9000中过量表达ASS或ASL可以引发精氨酸代谢流量的上调,进而提高了细胞的多种胁迫抗性。精氨酸合成途径广泛存在于多种微生物中,为微生物,尤其是工业微生物提高胁迫抗性提供了新思路。     

基于同源重组的裂殖壶菌遗传转化体系的构建及验证

【目的】裂殖壶菌是一种能高效生产DHA的海洋真菌;基因工程技术已经成功应用在微生物改造和代谢机理研究中,利用基因工程技术对裂殖壶菌进行改造首先需要构建适合裂殖壶菌的遗传转化体系;【方法】本文利用电转化的方法将含有18S r DNA同源重组片段的ble基因导入裂殖壶菌中,通过zeocin抗性平板筛选出阳性菌株,并设计ble基因引物,以裂殖壶菌基因组为模板,进行PCR验证ble基因是否成功结合到裂殖壶菌染色体上。【结果】筛选获得的抗性菌株基因组上确实PCR出ble基因片段,对改造菌株与原始菌株进行发酵培养,发现改造后菌株在生物量、油脂含量、DHA含量及脂肪酸分布等方面和原始菌株基本一致。【结论】抗性基因的插入不会影响菌株的正常代谢,该体系的构建为后续其他外源基因导入奠定基础。     

珠穆朗玛峰北坡可培养石生细菌多样性及抗紫外辐射能力

【背景】珠穆朗玛峰地区具有寒冷低温、强辐射等极端环境条件,珠穆朗玛峰北坡石生微生物研究未见报道。【目的】针对珠穆朗玛峰北坡石生微生物开展研究,阐明珠穆朗玛峰北坡石生生境中可培养细菌多样性,开发珠穆朗玛峰北坡抗紫外辐射菌株资源。【方法】通过可培养法、16S rRNA基因序列分析方法以及紫外辐射筛选对珠穆朗玛峰北坡可培养石生细菌多样性以及抗紫外辐射能力进行研究。【结果】从珠穆朗玛峰北坡石生生境中共分离获得52株石生细菌,归类为放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),其中放线菌门和变形菌门为优势菌门,鞘脂单胞菌属、节杆菌属、链霉菌属为优势菌属,有2株菌为潜在新种。从已分离鉴定菌株中筛选出了2株抗紫外辐射能力较高的菌株,分别是芽孢杆菌属菌株ZFBP4009和链霉菌属菌株ZFBP1009。【结论】珠穆朗玛峰北坡石生环境蕴含多样性丰富的石生细菌,所分离菌株抗紫外辐射能力突出,为揭示相关极端环境下微生物的分布特征及极端环境微生物资源开发提供了数据支持及菌株资源。     

Expression of Deinococcus radiodurans PprI enhances the radioresistance of Escherichia coli

PprI, a newly identified gene switch responsible for extreme radioresistance of Deinococcus radiodurans, plays a central regulatory role in multiple DNA damage repair and protection pathways in response to radiation stress [Biochem. Biophy. Res. Commun. 306 (2003) 354]. To evaluate whether PprI also functions in the radioresistance in other organisms, D. radiodurans PprI protein (Deira-PprI) was expressed in Escherichia coli. The complemented E. coli strain showed an increase of approximately 1.6-fold radioresistance with a high dose of gamma irradiation. Immunoblotting assays showed that the expression of Deira-PprI in E. coli resulted in a significant increase in RecA protein expression following high dose ionizing radiation. The expression of Deira-PprI protein also significantly enhanced the scavenging ability of free radicals by inducing the enzymatic activity of KatG. These results indicate that exogenous expression of Deira-PprI promotes DNA repair and protection pathways and enhances the radioresistance of E. coli.     

高通量测序分析云南腾冲热海热泉微生物多样性

【背景】云南腾冲热海热泉中蕴含着丰富的极端微生物资源。【目的】揭示云南腾冲热海热泉中微生物物种多样性及群落结构差异,发掘酸性热泉中铁、硫氧化功能微生物。【方法】采用Illumina HiSeq高通量测序技术对3处热泉15个水体样品中微生物16SrRNA基因V4-V5区进行测序及生物信息学分析。【结果】3处热泉中共获得578061条有效序列,聚类为141个可操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU),包括19个门66个属。鼓鸣泉(GMQ)、蛤蟆嘴(HMZ)、黄瓜箐(HGQ)3处热泉均以泉古菌门(Crenarchaeota)和厚壁菌门(Firmicute)为主。从属水平分析,碱性热泉鼓鸣泉(GMQ)和中性热泉蛤蟆嘴(HMZ)分别注释到37、32个属,优势属均为芽孢杆菌属(Bacillus)和热棒菌属(Pyrobaculum)。酸性热泉黄瓜箐(HGQ)共注释到20个属,优势属为酸杆菌属(Acidibacillus)和酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus),此外,具有铁、硫氧化潜力的菌属有喜酸菌属(Acidicaldus)、硫化芽孢杆菌属(Sulfobacillus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)及生金球菌属(Metallosphaera)等,进一步通过硫氧化培养基分离获得了这些菌属中的纯菌株。【结论】云南腾冲热海热泉水体中蕴含丰富的微生物资源,热泉间微生物物种组成差异明显;酸性热泉中存在多种具有潜在铁、硫代谢功能的菌种;未分类类群、非培养类群丰度很高,尤其是蕴藏着可观的古菌资源。     

浓香型白酒发酵过程微生物合成正丙醇途径解析

【目的】揭示浓香型白酒窖内发酵过程与正丙醇合成相关的微生物和代谢途径。【方法】通过对浓香型白酒窖内发酵过程酒醅中微生物的宏转录组进行分析,解析与正丙醇合成相关的微生物和代谢途径,并验证相关微生物合成正丙醇的能力。【结果】浓香型白酒窖内发酵过程中有3条可能的酒醅微生物合成正丙醇的途径。真菌主要通过2-甲基苹果酸代谢途径和苏氨酸代谢途径合成正丙醇,细菌则主要通过丙酸代谢途径合成并参与苏氨酸代谢途径。宏转录组测序分析表明,这3条途径对白酒窖内发酵过程正丙醇的合成与积累均有贡献,并且微生物通过这3条途径合成正丙醇的时期和能力存在较大差异。此外,对分离自酒醅的酵母和乳酸菌合成正丙醇能力分析发现,它们均与浓香型白酒窖内发酵过程正丙醇的合成有关。【结论】本研究揭示了浓香型白酒窖内发酵过程中正丙醇合成相关的微生物和代谢途径,为阐明白酒发酵过程中正丙醇的形成机制奠定了理论基础。     

安徽定远盐矿可培养嗜盐微生物多样性

【背景】嗜盐微生物多生活于高盐环境,具有独特的生理代谢特征,是一类重要的极端环境微生物资源。【目的】为更好地认识我国陆相盐矿的嗜盐微生物多样性组成,更好地开发利用嗜盐微生物资源积累丰富的微生物菌种。【方法】对安徽定远盐矿盐芯样品进行嗜盐微生物的纯培养分离,并对所分离菌株进行基于16SrRNA基因的测序和序列相似性分析,并对所分离菌株进行物种多样性分析。在此基础上,对代表菌株进行菌落形态和耐盐度及酶活测定。【结果】通过纯培养共分离获得了嗜盐微生物264株,其中嗜盐古菌150株,占56.8%;嗜盐细菌114株,占43.2%。嗜盐古菌物种分别来自于Halorubrum、 Halopenitus、 Haloterrigena、 Natrinema、 Natronoarchaeum和Natronomonas等6个属;嗜盐细菌物种分别来自于Pseudomonas、Aliifodinibius、Halobacillus、Halomonas和Halospina等5个属。通过代表菌株的酶活平板检测,发现产胞外蛋白酶菌株1株,酯酶1株,淀粉酶2株;能液化明胶菌株2株。在物种多样性组成方面,发现嗜盐古菌的物种多样性指数高于嗜盐细菌。【结论】本研究对我国安徽定远陆相盐矿的可培养嗜盐微生物多样性进行探究,积累了丰富的嗜盐微生物菌株资源。     

arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性

【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以P.putida JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入E.coli JM109(DE3)中,验证该基因提高E.coli JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到E.coli JM109(DE3)基因组中。【结果】E.coli JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到E.coli JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受E.coli JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。