苏×香F_1代JHDM1A基因多态性与生长性能相关性分析

为了解苏太猪(♂)×香猪(♀) F1代JHDM1A基因与生长性状的相关性。试验采用61头苏×香F1代杂交猪为研究对象,应用PCR扩增及PCR-RFLP技术对杂交猪JHDM1A基因的3'-UTR区多态性进行生长相关性分析。结果表明,JHDM1A基因3'-UTR区的g.244CG位点与体长、臀腿围、体重、胸围和体高均存在显著(p0.05)或极显著(p0.01)相关,CG基因型生长性能优于CC基因型,C等位基因频率高于G等位基因。因此,该位点多态性可作为猪生长性能相关基因进行考察。     

猪个体基因杂合度对生长性状的影响

逐个测定 139头F2 代杂交猪 (Susscrofa) (英系大白猪×梅山猪 )的初生重、180日龄活重 (LWT180 )、日增重(ADG)、相对生长率 (RGR)和KR值等 5个生长性状 ,对每一个体分别进行 2 4个微卫星座位的基因分型。对性别、家系和标记与生长性状的关系进行分析 ,结果显示 :它们与这些生长性状没有显著关联 (P >0 0 5 )。以 2 4个中性微卫星座位的杂合度来表示个体基因杂合度 ,比较猪生长性状在各个体基因杂合度水平间的差异 ,并分析其变化规律。结果表明 :初生重从个体基因杂合度水平为 1( 1 5 185kg)时至杂合度水平为 2 ( 1 30 6 3kg)时达性状最低值 ,之后随基因杂合度水平的增加而增加 ;180日龄活重、日增重、相对生长率和KR值等 4个重要经济性状随个体基因杂合度的增加呈近似于正弦函数曲线变化 ,在个体基因杂合度水平 2 (杂合度为 0 5 796 )时的性状值最高 ,之后随着个体基因杂合度的增加而降低。同一性状在不同的个体基因杂合度水平表型值不同 ,在某一特定的杂合度水平时达最高 ,提示在猪选配时将个体基因杂合度控制在恰当的水平 ,可以使目的性状的表型值最高。     

西藏小型猪F1代与F0代生长繁殖性能的比较

目的比较研究广州地区西藏小型猪F1代与F0代引入群母猪繁殖和仔猪生长性能的差异。方法观察记录西藏小型猪F1代和F0代的产仔数、产活仔数、离乳仔数、初生重、30日龄和60日龄体重。结果西藏小型猪F1代和F0代母猪其初产平均产仔数、产活仔数、离乳仔数、平均初生重、30日龄和60日龄体重分别为3.83头、2.30头;3.29头、2.20头;3.14头、3.11头;0.66 kg、0.53 kg;2.70 kg2、.30 kg;4.50 kg、4.01 kg;F1代初产仔数和离乳率均显著高于F0代。结论西藏小型猪已经适应了广州高温高湿环境,能够稳定地生长繁殖。     

13/17罗伯逊易位猪POU1F1基因多态性

采用外周血淋巴细胞培养制备染色体标本, 对13/17罗伯逊易位猪的3种杂交组合的394头后代进行核型分析, 出现3种核型猪：13/17易位纯合子猪[2n=36, XY或XX, rob(13;17)]、13/17易位杂合子猪[2n=37, XY或XX, rob(13;17)]和正常核型猪[2n=38, XY或XX]。应用PCR-RFLP技术在POU1F1基因的1 746 bp扩增片段中检测到1个RsaⅠ限制性内切酶的多态位点。应用PCR-SSCP技术检测POU1F1基因第4外显子, 在3种杂交后代群中均未检测到突变。遗传多态性分析结果表明：RsaⅠ酶切多态位点的突变在3种杂交后代群中A等位基因和AA基因型频率占优势, 在3种核型群体中也是A等位基因和AA基因型频率占优势, 其中AB基因型频率在易位杂合型群体中较高。各杂交后代群均未达到Hardy-Weinberg平衡, 不同核型群亦处于非平衡状态。13/17易位杂合子猪×13/17易位杂合子猪和13/17易位杂合子猪×约克两杂交后代群的PIC表现为中度多态, 而13/17易位杂合子猪×皮杜杂交后代群表现为低度多态; 易位杂合型群体表现为中度多态, 正常核型和易位纯合型群体表现低度多态性。     

转pGH基因猪血清pGH含量的分析

用ELISA方法分别测定了3头F0代成年阳性猪和8头F1代幼年阳性猪血清 pGH的水平,发现阳性个体间在激素含量及变化趋势上有很大差别,其中F1代个体pGH变化趋势与阴性对照较为一致。研究结果表明阳性个体本身性别及生理状况与外源基因表达有关,同时也反映出外源 pGH基因的表达状况与该基因在宿主基因组中的插入位点不同有着密切的联系。     

转pGH基因猪血清pGH含量的分析

用ELISA方法分别测定了 3头F0 代成年阳性猪和 8头F1代幼年阳性猪血清pGH的水平 ,发现阳性个体间在激素含量及变化趋势上有很大差别 ,其中F1代个体pGH变化趋势与阴性对照较为一致。研究结果表明阳性个体本身性别及生理状况与外源基因表达有关 ,同时也反映出外源pGH基因的表达状况与该基因在宿主基因组中的插入位点不同有着密切的联系。     

应用CRISPR/Cas9技术制备Ace2基因敲除小鼠模型及基因型的鉴定

本研究旨在应用CRISPR/Cas9技术高效构建Ace2 (angiotensin-converting enzyme 2)基因敲除小鼠模型,并繁殖、鉴定及验证Ace2基因敲除小鼠。通过构建靶向敲除Ace2基因的载体,体外将Cas9 mRNA和向导RNA (guide RNA, gRNA)显微注射到小鼠受精卵中,通过PCR和TA克隆测序对小鼠Ace2基因的第3至18号外显子删除情况进行检测和鉴定,繁育Ace2基因敲除小鼠并利用qRT-PCR和Western blot方法验证获得的Ace2~(-/Y)小鼠主要脏器中Ace2 mRNA和蛋白表达情况。结果显示,顺利构建表达gRNA载体并体外转录,成功将有活性的gRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵,获得6只阳性F0代初建鼠,PCR和基因测序鉴定表明成功删除了小鼠Ace2基因的第3至18号外显子;F0代鼠与野生型鼠回交,得到3只阳性F1代鼠,再与野生型鼠相交配得到的后代为F2代,在F2代中选择Ace2~(-/+)雌性杂合子鼠与野生型鼠交配,获得F3代Ace2~(-/Y)雄性纯合子小鼠。qRTPCR和Western blot结果表明,F3代Ace2~(-/Y)小鼠肾脏和肺中未检测到Ace2 mRNA和蛋白表达。本方法通过CRISPR/Cas9技术成功制备了Ace2基因敲除小鼠模型,为进一步研究Ace2基因功能奠定了基础。     

猪下丘脑和垂体中生长激素受体、胰岛素样生长因子1型受体的发育性变化

GH和IGF-1可作用于垂体或/和下丘脑负反馈性地调节垂体GH的分泌,而这种负反馈作用必须通过下丘脑或垂体的GHR和IGF-1R来实现.为研究猪垂体GH分泌负反馈调节的发育性变化和品种特点,分别在0、3、20、30、90、120和180日龄随机选取纯种雄性二花脸猪和大白猪各4头,屠宰并取下丘脑及垂体,用相对定量RT-PCR分析下丘脑和垂体GHR和IGF-1R mRNA水平.结果表明下丘脑GHR mRNA表达呈明显的时序性变化,在0到120日龄期间呈逐渐上升趋势,180日龄时显著下降(P＜0.05),提示在快速生长期,GH负反馈调控机制逐渐加强.下丘脑GHR mRNA表达还表现明显的品种间差异,在0到180日龄期间大白猪均显著高于二花脸猪(P＜0.05);而垂体GHR mRNA表达相对稳定,品种和年龄间差异不显著,提示GH的负反馈作用位点可能主要在下丘脑.IGF-1R与GHR的表达发育模式不同.下丘脑IGF-IR mRNA的表达相对稳定,无显著的年龄、品种间差异;而在垂体,大白猪和二花脸猪IGF-1R mRNA水平在出生时均较高,随后显著下降(P＜0.05),20日龄后逐渐上升至90日龄的较高水平,随后再次下降.大白猪垂体IGF-1 mRNA表达在30日龄和90日龄时显著高于二花脸猪(P＜0.05),而180日龄时二花脸猪垂体IGF-1R mRNA水平却显著高于大白猪(P＜0.05).结果提示,IGF-1长环负反馈作用位点可能不在下丘脑,而主要在垂体.     

睾丸注射法制备携带猪PID1基因的转基因兔

目的研究磷酸酪氨酸互作结构域1(PID1)基因与肌内脂肪含量的关系,探究睾丸注射法在转基因动物制备中的可行性。方法将携带猪PID1基因的重组质粒pIRES2-acGFP-PID1与转染试剂共孵育后,对新西兰兔进行了睾丸打点注射试验。对繁殖的F1代个体进行了活体荧光检测、PCR和western blotting检测,以及抽样屠宰进行肌内脂肪含量等检测;将F1代阳性个体互交,繁殖了F2代兔,对其进行了阳性率检测以及肌内脂肪含量检测。结果外源PID1基因和荧光蛋白基因在后代中均成功表达,其中,F1代阳性率为35.88%,F2代阳性率为34.33%;转基因阳性兔与阴性和空白对照兔相比,PID1蛋白表达水平有所增加,肌内脂肪含量有显著提高(P0.05)。结论 PID1基因与肌内脂肪沉积密切相关,同时,进一步证明了睾丸注射法可以用于制备转基因动物,且外源基因可以稳定遗传。     

猪MyoG基因3′端PCR-SSCP遗传多态性及其遗传效应(英文)

采用PCR-SSCP方法对长白猪、大白猪、杜洛克猪、山西黑猪和马身猪共636头猪的肌细胞生成素(Myogenin,简称MyoG)基因3′端的遗传多态性进行检测,分析MyoG基因对猪的初生体质量、断奶体质量、6月龄体质量和背膘厚的影响。根据已发表的猪MyoG基因3′端侧翼序列设计3对引物,发现F1/R1引物对扩增的片段有多态性。统计结果发现:长白、大白、杜洛克猪种B基因为优势基因,其基因频率分别为0.8807、0.7256和0.8581;山西黑猪种A基因为优势基因,其基因频率为0.9359;马身猪种只检测到A基因。χ2独立性检验表明,基因型分布在外来猪种(长白猪、大白猪、杜洛克猪)与地方猪种(山西黑猪、马身猪)间存在极显著差异(P<0.01)。固定效应模型分析结果表明,初生体质量基因型间差异显著(P<0.05),而断奶体质量、6月龄体质量和背膘厚基因型间差异不显著(P>0.05)。最小二乘分析结果表明,BB基因型与其它2种基因型比较有较大的初生质量,同AA和AB型比较差异极显著(P<0.01)。因此,推测MyoG基因对个体的初生体质量存在一定的影响,选择带有B等位基因的个体有望提高个体的初生体质量。     

罗伯逊易位群体遗传结构的DNA指纹分析

用微卫星探针（GGAT）4得到了罗伯逊易位猪群体内共9个家猪品种的DNA指纹图。1－9品种依次为：13／17罗伯逊易位纯合子猪群体、13／17罗伯逊易位杂合子猪群体、13／17罗伯逊易位杂合子猪互交所得到的正常核型猪群体（杂交0号）、丹系长白猪群体、加系双肌臂杜洛克猪群体、加系双肌臀大约克猪群体、加系双肌臀长白猪群体、丹系长白猪与13／17易位杂合子猪产生的杂交后备猪群体（杂交1号）、杜洛克猪与13／17易位杂合子猪产生的杂交后备猪群体（杂交2号）。根据指纹带型计算了每个群体的相似系数（F）、平均等位基因频率（Q）、最底平均杂合率（H）和遗传距离指数（D）。9个品种的相似系数介于0．546－0．931,根据各品种之间的遗传距离指数作出矩阵图,并据此绘制出品种间亲缘关系树状聚类图。     

版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)生长激素受体基因(GHR)序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RTPCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果克隆出了BMI GHR编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p.E381D、p.A409S、p.L556V和p.A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示:GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。     

应用CRISPR/Cas9技术构建YOD1基因敲除小鼠

目的:应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法:针对YOD1基因设计单链向导RNA(sg RNA)识别序列,构建sg RNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后,取同窝对照的野生型(WT)和敲除(KO)小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹(WB)技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子(HET)自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验(GTT)分析KO小鼠的血糖调控能力。结果:基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论:应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异。     

4个贵州地方猪品种MKLN1基因中SNP位点的多态性研究

本研究在香猪和柯乐猪单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片筛查的基础上,采用AS-PCR技术,以香猪、柯乐猪、糯谷猪、黔北黑猪4个贵州地方猪品种为研究对象,研究muskelin 1基因第18外显子中rs81213998(DIAS0003365)位点的多态性与体尺指标之间的关系。结果显示,MKLN1第18外显子中rs81213998位点基因型在4个猪群中有多态性。香猪的C等位基因频率明显高于其它3个猪品种的相应值(p0.01),T等位基因的频率较低(p0.01),黔北黑猪、糯谷猪和柯乐猪的C和T之间的差异不明显(p0.05)。相关性分析显示,rs81213998位点与猪的管围、体长、体高、体宽呈弱的正相关。推测MKLN1基因的rs81213998位点可能与贵州地方猪品种的体尺指标之间有一定的关系。     

雌性藏猪不同生长发育阶段肌肉生长和脂肪沉积相关基因的表达模式

本研究利用包含140个与猪肌肉生长和脂肪沉积密切相关基因的Oligo功能分类基因芯片检测了藏猪在2、4、6和8月龄间背最长肌中这些基因的表达量变化,并在2月龄时与脂肪型的太湖猪和瘦肉型的长白猪进行比较.ANOVA分析结果表明:2-8月龄间藏猪分别有10和 7个基因的表达差异达极显著(P<0.01)和显著水平(P<0.05);2月龄时藏猪体重极显著低于长白猪(P<0.01)和显著低于太湖猪(P<0.05),而藏猪肌纤维面积却为最大,但品种间差异未达显著水平(P>0.05);2月龄时3个品种间分别有15和13个基因的表达差异达极显著 (P<0.01)和显著水平(P<0.05).STEM聚类分析结果表明:直线下降和上升是藏猪在2 -8月龄间最具代表性的基因表达模式(P<0.01).另外,5个差异表达基因的荧光定量RT -PC R验证结果与基因芯片结果的Person相关系数平均高达0.856±0.109.提示:藏猪在2-8月龄间骨骼肌生长发育强度较肌内脂肪合成沉积占优势,2月龄时藏猪脂肪酸合成相关基因的表达水平较其他两品种低,而脂肪酸β氧化和肌纤维生长相关基因的表达水平较高,与其在高原独特的自然生态环境和全放牧散养的饲喂方式下长期形成的品种特性相符 [动物学报 54(3):442-452,2008].     

猪Pit-1基因多态性及其与生长性状的关联分析

利用现代分子标记技术寻找影响猪生长性状的标记基因座,为应用标记辅助选择培育高生产性能猪的品种或品系提供帮助。本试验采用PCR-RFLP(RsaⅠ限制性内切酶)分子标记技术,分析了杜洛克、长白、大白及长大二元杂交4个品种共381头猪Pit-1基因exon 5至intron 5内多态性,并采用最小二乘法分析了Pit-1基因多态性对生长性状影响的遗传效应。经检测,4个品种Pit-1基因RsaⅠ位点均存在多态性。等位基因A的基因频率分别为0.831 7、0.830 2、0.676 7、0.752 3,A为优势基因。被测猪群Pit-1基因的基因频率在被测猪群中均处于Hardy-Weinberg平衡状态(p0.05)。最小二乘分析表明:Pit-1基因3种基因型的猪在出生重、断奶重及70日龄重性状上均呈现BBABAA趋势(其中,长白猪只存在AB,AA 2种基因型),B为优势基因。Pit-1基因exon 5至intron 5 RsaⅠ位点多态性对测试猪群生长性状有一定影响,但是否是影响生长性状的一个候选基因之一或是与影响猪生长性状的QTL连锁的基因,还需进一步研究。     

不同猪种IGFBP3基因内含子2、3多态性分析

本研究采用PCR-SSCP技术结合DNA直接测序对滇南小耳猪、大白猪、梅山猪、香猪、海南五指山猪封闭群、近交系、海南黑猪系(临高猪,屯昌猪)等8个猪种的IGFBP3基因内含子1、2、3的SNP多态性进行检测,并分析其与五指山猪3个生长阶段体质量的关联性。结果表明:内含子2、3的PCR片断表现有多态性,且出现3种基因型。随后的测序结果表明,它们都在相应的区域存在着SNP变异;内含子3在地方猪种大多表现BB基因型和以B等位基因为主,尤其是小型猪;内含子2在中外不同猪种的基因型频率和等位基因的频率分布则不存在品种的特异性,在地方猪种和外来猪种的分布规律不明显。群体遗传多态性检测显示8个猪种在这2个位点均处于中度多态(0.25PIC0.5);关联分析显示五指山猪IGFBP-3内含子3 AA基因型和内含子2 DD基因型猪在8月龄、12月龄的生长体重分别与AB、BB基因型和CC、CD基因型个体存在显著性差异(p0.05),但在2月龄时没有此规律。     

绵羊皮肤中GHR、IGF-1和IGF-1R基因表达的发育性变化及品种特点

采用相对定量反转录多聚酶链式反应 (RT-PCR)方法, 以18S rRNA作内标, 研究了罗米丽(Romilly Hillys)×中国美利奴(新疆军垦型)杂交一代优质细毛羊和哈萨克粗毛羊皮肤中生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R) mRNA发育性变化并进行了品种间比较。分别于30、60、90、135、180和255日龄称重、采毛样, 并于30、90、135和255日龄采皮样。结果表明: 粗毛羊和细毛羊体重、羊毛生长的发育模式没有明显的差异, 30~135日龄体重迅速增加, 135~255日龄增重十分缓慢; 30~135日龄羊毛日增长逐渐增加, 135~180日龄羊毛生长十分缓慢, 而180~255日龄又上升到较高水平。粗毛羊皮肤中GHR mRNA在30~90日龄显著增加 (P<0.05), 90日龄达到高峰, 此后显著下降(P<0.05); 细毛羊在135日龄时GHR mRNA极显著地升高(P<0.01), 此后又极显著地下降。粗毛羊皮肤中IGF-1、IGF-1R mRNA 30~90日龄上升, 90日龄之后极显著下降(P<0.01); 细毛羊皮肤中IGF-1、IGF-1R mRNA出生时较高, 然后逐渐下降。品种之间比较, 细毛羊GHR mRNA出现高峰晚于粗毛羊, 135日龄高峰时显著地高于粗毛羊; 粗毛羊IGF-1、IGF-1R mRNA在90日龄出现高峰, 并极显著或显著地高于细毛羊; 粗毛羊90日龄前GHR、IGF-1和IGF-1R mRNA高于细毛羊, 之后低于细毛羊。结果提示: 绵羊皮肤中GHR、IGF-1和IGF-1R基因表达有特定的发育模式, 并存在品种差异。     

《免疫学杂志》：科学家建立基因敲除免疫缺陷小猪模型

近期,中科院广州生物医药与健康研究院的科学家成功建立了基因敲除免疫缺陷小型猪模型。该成果日前在线发表在《免疫学杂志》上。 广州生物院赖良学团队利用TALEN技术在小型猪中敲除了RAG基因,获得了重症联合免疫缺陷小型猪模型,研究人员对猪的胎儿成纤维细胞进行转染后获得杂合和纯合的RAG1／2敲除的细胞克隆。细胞克隆用于体细胞核移植后获得27头克隆猪,其中有10头为RAG2单等位碱基缺失,9头为RAG1双等位碱基缺失,3头为RAG2双等住碱基缺失,这些碱基缺失都导致了外显予读码框移码。敲除猪表现出典型的重症联合免疫缺陷疾病特征,包括胸腺萎缩,脾脏发育不良,淋巴细胞减少等。