基于果蝇DNA甲基化的AFLP体系的建立及优化

以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Canton-S品系为材料,采用改良SDS法提取高质量DNA,对连接、预扩增及选择性扩增进行分析,建立适用于果蝇基因组DNA甲基化多态性研究的AFLP优化体系:1)10μL连接体系加T4连接酶1 U,AluⅠ接头50 pmol,EcoR Ⅰ接头5 pmol,4℃反应12 h;2)25μL预扩增体系含Mg2+0.2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,模板1.0μL,Taq DNA聚合酶2 U,E-00 50 ng,A-00 50 ng;3)25μL选择性扩增体系含Mg2+0.1 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,模板2.0μL,Taq DNA酶1.5 U、E+340 ng,A+3 40 ng.该体系稳定性高、重复性好,适用于果蝇基因组DNA甲基化多态性研究.     

正交设计优化玉米SSR-PCR反应体系的研究

为建立适宜玉米SSR-PCR的反应体系和扩增程序,利用正交设计L16(45)表,对反应体系的模板DNA、dNTPs、Primers、Taq DNA聚合酶的浓度进行4因素4水平优化筛选和扩增程序的优化,确立了最优反应体系和扩增程序.即在10 μL体系中,模板DNA 20 ng,1×PCR buffer,dNTPs 62.5 pmol/μL,Primers0.25 pmol/μL,Taq DNA polymerase 0.5 U.反应程序为:94℃预变性5 min:94℃变性45 s,60℃退火45 s,72℃延伸1 min,32个循环;72℃延伸5 min,4℃保存.使用300对SSR引物对重组近交系的两亲本扩增,筛选出条带清晰,有差异的引物94对,用于基因连锁图谱构建和QTL定位.     

cDNA-AFLP比较当归早薹基因转录差异反应体系的建立

建立了利用cDNA-AFLP技术对当归早薹相关的差异表达基因进行筛选的方法,优化了影响cDNA-AFLP试验结果的关键因子,包括选择性扩增模板量、酶离子浓度、dNTP浓度。结果表明,以1μL稀释10倍的预扩增产物作为模板、1.5 mmol/LMgCl2、0.6 mmol/L dNTP,进行的选择性扩增反应获得DNA片段分子量范围较广,在100-1 000 bp长度范围中均有扩增片段,是较为理想的选择性扩增的结果。聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了试验结果,在优化条件下利用部分引物组合可以较好地比较早薹当归在基因转录水平发生的差异。     

甘蔗双低频酶cDNA-AFLP体系的优化

目的：建立一个适合于甘蔗（Saccharum officenarum）为研究材料的cDNA-AFLP反应的优化体系。方法：用Rever-tAidTM First Strandc DNA Synthesis Kit反转录获得第一链,用Rnase H、E.coliDNA聚合酶Ⅰ和E.coliDNA连接酶合成双链cDNA,用双低频酶EcoRⅠ和PstⅠ对dscDNA酶切,连接,预扩增,和选择性扩增的关键因素进行分析。结果：500ng的dscDNA双酶切5h,将16℃过夜连接的产物稀释1倍用作预扩增的模板,预扩增产物稀释50倍作为选择性扩增模板,6%聚丙烯酰胺凝胶检测及银染,扩增条带均匀分布,清晰可辨且主要分布在200～2000bp之间。结论：该体系具有稳定性高,重复性好等优点,可用于甘蔗cDNA-AFLP分析。     

甘菊cDNA-AFLP反应体系的优化

以甘菊为试验材料,研究了影响cDNA-AFLP反应体系的几个关键因素,建立了适宜甘菊的cDNA-AFLP分析体系,并得到了清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱.结果表明:适用于甘菊叶片总RNA提取的方法为改进的Trizol法;酶切连接采用一步法,dscDNA酶切用量为300 ng,酶切连接时间为8 h;PCR选择性扩增反应时,反应体系中最佳组合为:引物浓度0.4 mM、Mg2+浓度1.25 mM、Taq酶浓度0.9 U、dNTP浓度0.3 mM.     

橡胶树AFLP银染体系的建立和优化

目的:扩增片段长度多态性(AFLP)为遗传图谱的构建及育种的辅助选择提供了有力的工具。建立一套适合橡胶树的AFLP技术优化体系。方法:以197个GT1×IAN873橡胶树杂交群体为材料,通过对影响AFLP的多种关键因素如模板DNA质量、酶切连接体系、酶切连接反应时间、预扩增体系、选择性体系的分析进行研究。结果与结论:找出一套适于热带植物基因组DNA提取及橡胶树AFLP技术。用改进的CTAB法,经多次抽提纯化,用细玻璃棒挑出DNA得到高质量的模板DNA;酶切连接时DNA模板为250ng,反应体系采用各3U的EcoRⅠ/MseⅡ/T4连接酶,反应时间为9h;预扩增模板为稀释1/2的酶切连接产物,用量为1μL;选择性扩增要用稀释至1/20的预扩增产物。     

芒AFLP反应体系的建立

以芒DNA为材料,对AFLP分子标记分析中的基因组酶切体系选择性扩增中Mg2+、dNTP和Taq酶浓度等4个因素进行了比较。结果表明20μL基因组双酶切体系中,使用1UEcoRⅠ和1UM seⅠ酶切3 h能够实现完全酶切;选择性扩增的PCR 10μL反应体系中1.4 mmol.L-1Mg2+,0.4 mmol.L-1dNTP及0.6 U Taq酶是进行芒AFLP分析的最佳反应条件,能够得到丰富稳定的带纹。该体系的构建为AFLP技术在芒相关研究中的应用奠定了基础。     

丹参MSAP分子标记技术体系的优化及其应用

以陕西省野生丹参为材料利用正交设计对MSAP预扩增和选择性扩增体系中关键因素优化筛选,以建立适合丹参的MSAP反应体系,并用于5个野生丹参居群表观遗传多样性分析.结果表明:25μL MSAP双酶切反应体系中加入EcoRⅠ和MspⅠ各10 U,37℃酶切8 h,酶切较充分;最佳预扩增反应体系25μL,包含连接产物2.5μL,Mg2+(25 mmoI/L)1.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.4μL,上下游引物E00/HM00(50ng/μL)各1.0μL;最佳选择性扩增反应体系25μL,包含稀释100倍的预扩增产物1.5 μL,Mg2+(25 mmol/L)2.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.1μL,上下游引物E-ACG/HM-CAA(50 ng/μL)各0.8μL.选用5对引物组合对5个野生丹参居群的50个单株进行表观遗传多样性分析,平均DNA甲基化多态性谱带为95.48%;UPGMA聚类分析结果表明,50个丹参单株在相似性系数0.58处可分为3大类.     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的研究

应用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立一种准确、灵敏、快速的蜜蜂微孢子虫检测方法。本研究根据东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的依赖DNA的RNA聚合酶Ⅱ大亚基(RPB1)序列,用在线软件Primer Explorer V4.0 online设计4条特异性引物,分别对Mg2+、d NTP、内引物FIP/BIP和甜菜碱浓度及反应温度和时间优化;选择蜜蜂体内常见病原进行该方法的特异性验证,用MseⅠ酶切扩增产物验证其准确性;将N.ceranae的DNA梯度稀释进行灵敏度检测并与PCR比较分析;最后在临床检测中验证该技术的可行性。结果表明,优化的体系可在恒温57℃下完成扩增反应;引物的病原特异性检测仅N.ceranae有梯状条带,MseⅠ酶切产物条带符合理论值;LAMP反应检测的灵敏度较PCR高10倍;能够直接从蜜蜂体内检测出N.ceranae。本研究建立的LAMP检测N.ceranae体系准确、快速、成本低,可为蜜蜂微孢子虫病的检测提供有力的技术支撑。     

芋ISSR-PCR扩增反应体系的建立

目的:获得清晰可靠、重复性较好的ISSR-PCR扩增反应体系,应用于芋种质资源进行遗传多样性的研究中.方法:以芋的幼叶提取基因组DNA为材料,采用正交试验设计L16(45),从模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度及TaqDNA聚合酶的用量5因素4水平出发,构建芋最佳反应体系.结果:芋ISSR-PCR的最佳反应体系为:在25μl的反应体系中,40ng DNA模板、0.4μmol/L引物浓度、2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1 U Taq DNA聚合酶.结论:利用芋种质资源对最佳反应体系的验证,结果显示该反应体系具有扩增稳定性.