南药益智AFLP-PCR体系的建立与优化

[目的]建立适合南药益智的扩增片段长度多态性(AFLP)扩增体系来研究不同地理居群益智遗传多样性。[方法]利用植物基因组试剂盒法提取高质量的益智基因组DNA,采用单因素和正交试验对AFLP过程中的酶切和PCR相关影响因素进行优化,并对适合益智AFLP分析的引物组合进行筛选。[结果]实验结果表明最佳酶切反应体系:模板DNA 0.6μg,酶量20 U,酶切时间2 h;最佳AFLP-PCR选择性扩增反应体系(总体积为25μL):10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5μL,d NTPs 2μL,Mg2+(25mmol/L)1.5μL,引物(10 pmol/μL)各2.0μL,Taq酶(5 U/ml)0.5μL,模板稀释25倍2μL。利用建立的最佳扩增体系从64对引物中筛选获得8对选择性引物适合益智AFLP分析。[结论]建立了稳定的AFLP-PCR体系,为研究益智遗传多样性的AFLP分析奠定了基础。     

基于果蝇DNA甲基化的AFLP体系的建立及优化

以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Canton-S品系为材料,采用改良SDS法提取高质量DNA,对连接、预扩增及选择性扩增进行分析,建立适用于果蝇基因组DNA甲基化多态性研究的AFLP优化体系:1)10μL连接体系加T4连接酶1 U,AluⅠ接头50 pmol,EcoR Ⅰ接头5 pmol,4℃反应12 h;2)25μL预扩增体系含Mg2+0.2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,模板1.0μL,Taq DNA聚合酶2 U,E-00 50 ng,A-00 50 ng;3)25μL选择性扩增体系含Mg2+0.1 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,模板2.0μL,Taq DNA酶1.5 U、E+340 ng,A+3 40 ng.该体系稳定性高、重复性好,适用于果蝇基因组DNA甲基化多态性研究.     

日本沼虾AFLP反应体系的建立

目的:建立一个适于日本沼虾研究用的 AFLP 反应体系.方法:以日本沼虾 DNA 为材料,对基因组酶切时间、选择性扩增中Mg2 、dNTP浓度、预扩增产物稀释倍数及选扩性引物M 3/E 3配比等进行了比较分析.结果:酶切5h,选扩 25ul PCR 反应体系中Mg2 2mmol/L,dNTP 1.2rmnol/L,预扩产物稀释 40 倍,选扩引物M 3/E 3配比为8:1,所得产物在毛细管电泳中可得剑稳定的结果.结论:该体系的构建为 AFLP 技术在日本沼虾相关研究中的应用奠定了基础.     

丹参MSAP分子标记技术体系的优化及其应用

以陕西省野生丹参为材料利用正交设计对MSAP预扩增和选择性扩增体系中关键因素优化筛选,以建立适合丹参的MSAP反应体系,并用于5个野生丹参居群表观遗传多样性分析.结果表明:25μL MSAP双酶切反应体系中加入EcoRⅠ和MspⅠ各10 U,37℃酶切8 h,酶切较充分;最佳预扩增反应体系25μL,包含连接产物2.5μL,Mg2+(25 mmoI/L)1.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.4μL,上下游引物E00/HM00(50ng/μL)各1.0μL;最佳选择性扩增反应体系25μL,包含稀释100倍的预扩增产物1.5 μL,Mg2+(25 mmol/L)2.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.1μL,上下游引物E-ACG/HM-CAA(50 ng/μL)各0.8μL.选用5对引物组合对5个野生丹参居群的50个单株进行表观遗传多样性分析,平均DNA甲基化多态性谱带为95.48%;UPGMA聚类分析结果表明,50个丹参单株在相似性系数0.58处可分为3大类.     

橡胶树MSAP反应体系优化及其不同开割高度单株DNA甲基化分析

以‘热研7-33-97’橡胶树无性系幼嫩叶片为材料,通过利用单因素和正交试验相结合的方法,对酶切、预扩增和选择性扩增3个影响甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析的关键步骤的反应体系中关键影响因素进行了优化,建立橡胶树MSAP反应最佳体系,并用于高低割线橡胶树基因组DNA甲基化差异分析。结果表明:在50μL反应体系中,750 ng基因组DNA用EcoRⅠ20 U,HpaⅡ20 U或MspⅠ10 U于37℃恒温同步酶切10 h,酶切完全。最佳预扩增体系(20μL)为:连接产物4μL,Mg Cl_2(25 mmol·L~(-1))0.15μL,d NTPs(2.5 mmol·L~(-1))0.1μL,上下游引物E-00/HM-00(10μmol·L~(-1))各0.3μL,Taq酶(5 U·μL~(-1))0.1μL,10×PCR Buffer 2μL。最佳选择性扩增反应体系(20μL)为:稀释20倍的预扩增产物2μL,Mg Cl_2(25 mmol·L~(-1))0.1μL,d NTPs(2.5 mmol·L~(-1))0.125μL,上下游引物E+3/HM+3(10μmol·L~(-1))各0.4μL,Taq酶(5 U·μL~(-1))0.1μL,10×PCR Buffer 2μL。高低割线树DNA的甲基化比例分别为37.22%和36.43%,2种开割胶树基因组CCGG位点胞嘧啶全甲基化率明显高于半甲基化率,推测橡胶树基因组甲基化主要模式可能是Cp G型。综上表明,建立的MSAP反应体系稳定可靠且重复性好,为后续橡胶树不同胁迫(割胶)程度DNA甲基化的研究奠定了基础。     

麻栎SRAP-PCR体系优化与遗传多样性分析

对麻栎基因组DNA的SRAP-PCR体系中dNTP、Taq酶、Mg2+、引物、模板DNA进行正 交试验优化,结果表明最佳反应体系为dNTP浓度为0.3 mmol*L-1,Taq酶1.5U, Mg 2+浓度为2mmol*L-1,引物浓度0.2ìmol*L-1,模板DNA 40ng(20ìL反 应体系).运用优化体系,从110对SRAP引物组合中,筛选出多态性较好的8对SRAP引物,对8 个不同地区麻栎进行SRAP标记分析.共检测到45个多态性位点,多态性条带百分比为51.72% .应用NTSYS-pc软件进行聚类分析(UPGMA),建立了麻栎亲缘关系树状图,表明SRAP可有效用于麻栎种质资源鉴定与遗传多样性分析.     

多倍体罗汉果PCR-RFLP参数的优化与应用

以多倍体罗汉果DNA为材料,采用L16(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验,研究Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等对PCR扩增结果以及内切酶量、酶切时间对酶切反应的影响。结果表明,多倍体罗汉果RFLP最优PCR反应体系和扩增参数为:在25μL扩增反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl_2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.1μmol/L,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板DNA 60 ng;退火温度为56℃,循环次数为35次。酶切反应体系:内切酶10×Buffer 2.0μL,内切酶5.0U,PCR产物15μL,超纯水补至20μL;酶切时间2 h。     

薰衣草高质量DNA提取及ISSR-PCR多重化体系的建立

以伊犁薰衣草‘701’新鲜叶片为材料,对4种基因组DNA提取方法进行比较,并通过单因子梯度比较试验结合L9(34)正交优化设计,对ISSR-PCR扩增体系中退火温度、DNA、Mg2+、dNTP和引物浓度进行最佳条件及配比筛选。结果表明,改良3×CTAB法是薰衣草高质量DNA少量提取的最佳方法 ;建立薰衣草ISSR-PCR扩增优化体系为,20μL反应体系中包括模板DNA 50 ng,Mg2+3 mmol/L,dNTP 0.3 mmol/L,引物0.3 mmol/L,Taq酶1 U;扩增程序退火温度为56℃。运用本试验建立的ISSR-PCR优化体系,对5份薰衣草种质进行了初步验证,获得了良好的多样性扩增条带。     

RAPD反应体系优化的研究

筛选随机扩增多态性DNA(RAPD)反应体系的最佳优化方案,以期获得稳定可靠的实验结果。选取对结果影响较大的4种因素(Taq酶、dNTP、引物、Mg2+)进行单因素设计,寻找最佳反应浓度。优化后得到4种因素的最佳反应浓度分别为Taq酶2.5U、dNTP 200μmol/L、引物1μmol/L、Mg2+2.5mmol/L。在优化的反应条件下,RAPD的稳定性和重复性均好。     

夏枯草DNA提取及RAPD反应条件的优化

用改进后的SDS法从夏枯草植物的新鲜叶片中提取基因组DNA,通过正交设计和单因素结合的方法对RAPD-PCR反应条件进行优化,确定了适合夏枯草DNA的最佳扩增体系:20μL的PCR反应体系中,模板DNA浓度1.0-2.0 mg/L,引物浓度1.00-1.50 mmol/L,Mg2 浓度2.0-2.5 mmol/L,dNTP浓度0.20-0.25 mmol/L,Taq酶用量0.5 U,10×BufferMg2 free 2μL,BSA浓度0.25-0.50μg/μL。     

怀地黄SRAP扩增体系的建立与引物的筛选

为建立适合怀地黄SRAP-PCR分子标记技术体系,通过单因子实验分别研究了DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度对怀地黄SRAP扩增反应的影响,确立了适合怀地黄SRAP最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA量20ng/25μL、2.5mmol/LMg2+、0.32μmol/L的上下游引物、0.30μmol/L的dNTP以及2.5UTaq酶,并利用确定的体系从88个引物组合中筛选出12对适合怀地黄SRAP-PCR反应的引物。     

西伯利亚蝗基因组DNA提取及RAPD分析条件的优化

以西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus(L.)为研究材料,利用改良的SDS法提取高质量的DNA,分别测试了dNTP浓度、镁离子浓度、TaqDNA聚合酶用量、模板DNA的量等因素对反应结果的影响。通过各因子的组合比较,建立了西伯利亚蝗RAPD优化体系:25μLPCR反应体系,10×buffer2·5μL;dNTP0·24mmol/L;MgCl22·0mmol/L;Taq DNA聚合酶1U;DNA模板45ng;引物30ng。扩增程序为:94℃预变性1min45s、94℃变性30s、35℃退火1min30s、72℃延伸2min,45个循环、72℃延伸10min。结果表明,利用优化的反应条件进行西伯利亚蝗基因组DNA分析,实验有着良好的重复性和稳定性。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

怀地黄ISSR扩增条件优化的研究

用CTAB法提取怀地黄嫩叶DNA,进行简单重复间序列标记(ISSR)分析.通过单因子实验分别研究了退火温度、Taq酶单位、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,找出各自的合适条件,而且每一个合适条件确定以后都被作为后续研究的一个条件.通过各个因子的组合研究建立了适宜于怀地黄ISSR分析的扩增体系25 μL PCR反应体积,1×Taq DNA酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,0.1% Trion X-100,pH9.0 ),2.5 mmol/L MgCl2,1.5～1.0 U Taq酶,60 ng模板DNA,0.4 μmmol/L引物,各0.4 mmol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP.合适的退火温度为53～55℃.为用ISSR技术分析鉴定怀地黄种质资源奠定了良好的基础.     

岩白菜ISSR-PCR反应体系的优化

目的:优化岩白菜ISSR-PCR反应体系,为利用ISSR标记进行岩白菜遗传多样性研究服务。方法:采用5因子4水平正交设计法优化岩白菜ISSR-PCR反应体系。结果:五个因子从大到小的影响力排序结果为:dNTPs>Mg2+>模板DNA>引物=Taq酶。岩白菜ISSR-PCR最佳反应体系为:总体积25μL,内含10×PCR缓冲液2.5μL、2.5 mmol.L-1Mg2+、2.0 U Taq酶、0.2 mmol.L-1dNTPs、0.48μmol.L-1ISSR引物、125 ng模板DNA。结论:研究获得的最佳反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,为利用ISSR标记技术研究岩白菜遗传多样性奠定了基础。     

濒危物种胡杨和灰叶胡杨总DNA提取及RAPD体系优化

以濒危物种胡杨和灰叶胡杨硅胶干燥的叶片为材料,研究其总DNA提取方法及RAPD-PCR体系优化条件。结果表明,用改良CTAB法提取的DNA适用于胡杨和灰叶胡杨的RAPD分析。优化的胡杨和灰叶胡杨RAPD-PCR体系为:20μL的反应体系中含Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTP 0.15 mmol·L-1、引物0.2μmol·L-1、模板DNA100 ng和1.5 U Taq DNA聚合酶。用6条多态性引物对优化体系的稳定性进行检测,结果显示扩增结果稳定,多态性丰富。该优化体系为在分子水平开展胡杨和灰叶胡杨的保护生物学研究提供了技术支持和参考。     

齿裂菌属和皮下盘菌属ISSR-PCR最佳反应条件的研究

在利用ISSR技术分析齿裂菌属和皮下盘菌属遗传多样性的研究中,为获得条带清晰、重复性好的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的条件进行了筛选,确定了此类菌物ISSR-PCR反应的最适宜条件:在15μLPCR反应体系中,10倍Taq酶缓冲液1.5μL,DNA模板8ng/μL,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,引物浓度0.4μmol/L,Taq酶1.00U,ddH2O9.0μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。     

木麻黄SSR-PCR反应体系的建立与优化

为得到木麻黄SSR-PCR反应的最佳体系,以4个种(短枝木麻黄、山地木麻黄、粗枝木麻黄、细枝木麻黄)的24个无性系为材料,采用L₁₆(4⁵)正交设计对影响木麻黄SSR-PCR反应的4个因素(Taq酶、dNTP、Mg²⁺和引物)在4个水平上进行了优化,并利用直观分析和方差分析两种方法对PCR结果进行评价。结果表明:引物、Mg²⁺和dNTP均对木麻黄SSR-PCR反应结果有极显著的影响(P<0.01),影响程度由大到小为:引物>Mg²⁺>dNTP,而Taq酶对扩增结果无显著影响;确定了两种木麻黄SSR-PCR反应体系(体系6和体系15),体系6为1×PCR buffer、2ng模板DNA、0.5μmol·L^-1引物、1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.1 mmol·L^-1 dNTP、0.5 U Taq酶;体系15为1×PCR buffer、2ng模板DNA、0.5μmol·L^-1引物、1.75 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.2 mmol·L^-1 dNTP、1.25 U Taq酶,反应体系共10μL,不足部分用ddH2O补足。从节约成本和降低非特异性产物的角度考虑可将体系6作为最佳体系,体系15为备用体系;本试验所选荧光引物M26、M36的退火温度在52~62℃均可扩增出清晰明亮的条带。为简化操作步骤和减少非特异性产物,可选择60℃作为引物M26、M36的最佳退火温度。     

美国黑核桃SSR反应体系优化

优化SSR-PCR反应体系是黑核桃（Juglans nigra L.）SSR基因鉴定和群体遗传等研究的基础。本研究通过对PCR反应中Mg²⁺浓度、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）浓度、Taq聚合酶用量、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA量的组合以及PCR程序组合试验,确定了黑核桃SSR的最佳反应体系,即在10 μL的PCR反应体系中,含10 ng模板DNA,0.1 mg·mL^-1牛血清蛋白（BSA）,0.25 mmol·L^-1 dNTPs,1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺ 1 μL 10X Taq DNA聚合酶反应缓冲液,0.5 U Taq聚合酶,1.0 mmol·L^-1单对引物（0.5 mmol·L^-13对引物）。SSR-PCR反应扩增程序为：94℃变性3 min;93℃变性15 s,50℃或者53.5℃退火1 min,72℃延伸30 s,32个循环;72℃后延伸10 min,置4℃保存。利用此反应体系对黑核桃进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定、可靠,适合进一步对黑核桃群体遗传、基因型鉴定和分子生态研究。     

朝鲜碱茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展朝鲜碱茅种质资源遗传多样性的研究,以野生朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)为材料,通过单因子试验对ISSR-PCR反应进行优化。确立最佳的PCR反应体系:在20μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,MgCl22.5 mmol/L和10×PCR Buffer(Mg2+free)2μL。此外,还筛选到10条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。