TNF-α影响胰岛素对原代培养大鼠脂肪细胞增殖及生脂基因的转录表达

采用RTPCR、MTT比色法和油红O染色提取法,分别测定外源TNFα、胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖及脂肪生成和碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)、固醇调控元件结合蛋白(SREBP)1c、脂肪酸合酶(FAS)及乙酰辅酶A羧化酶(ACC)1基因转录表达的影响。结果表明,TNFα可有效抑制胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖的促进作用,并通过抑制胰岛素对转录因子SREBP1c和脂肪酸合酶FAS及ACC1基因转录表达的促进作用,减少脂肪酸的生物合成,抑制成熟脂肪细胞的脂肪生成,证明TNFα是动物脂肪形成的有效抑制因子。此外,TNFα下调ChREBPmRNA表达,但胰岛素在低糖条件下对其表达没有明显影响     

结核分枝杆菌Rv2461c基因的克隆、表达、纯化及其抗原性的初步检测

目的:探索结核分枝杆菌Rv2461c基因编码的elpP蛋白作为结核检测抗原的可行性.方法:克隆结核分枝杆菌clpP蛋白的编码基因Rv2461e,构建pET30a-Rv2461c重组质粒,并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆栽体中,测序鉴定结果正确.将pET30a-Rv2461c重组质粒转化到大肠杆茵BL21中,表达纯化目的蛋白进行质谱分析.制备clpP蛋白的多克隆抗体,通过亚细胞分离及Western检测分析蛋白的亚细胞定位,纯化的clpP蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测.结果:结核分枝杆茵clpP蛋白大量存在于细胞质中,少量存在于细胞壁和细胞膜中.重组抗原在检测肺结核病人中的检出率为38.3%(23/60),检测敏感性为38-3%,特异性为90%.结论:为后续深入研究clpP蛋白的生物功能、clpP作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础.     

调控糖酵解和生脂的重要转录因子:碳水化合物反应元件结合蛋白

碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate response element binding protein,ChREBP）是最近发现和分离的一种重要的转录调控因子,它直接激活多个参与糖酵解和脂肪合成基因的表达,从而调控糖代谢和脂肪酸合成。研究ChREBP表达的调控机制及生物学效应,将有助于全面认识肥胖、糖尿病等代谢综合征的发病机制。本文综述了碳水化合物调控元件（carbohydrate response element,ChRE）及ChREBP的结构,ChREBPDNA结合活性的活化过程和分子机制,以及对靶基因的作用。     

脂肪生成中生理调节的生化机制

因为大多数动物都是间食的,所以它们就必须暂时将食物中的化学能尽多地贮留起来。以所贮的化学能每卡计,脂肪的体积及重量均较碳水化合物小,所以,在以碳水化合物为主食的动物体内,脂肪生成的首要意义就是将食物中碳水化合物中的能量以最大的效率贮存起来。脂肪生成的最主要生理稳定机能(homeostatie function)就是将食物中碳水化合物的化学能,在超过机体的能量需要时,以脂肪的形式贮存起来。显然,象脂肪合成这样对热平衡极其重要的过程,必有其精密的调节,才能迎合机体经常改变着的能量的需要。但有关脂肪生成调节的实验材料是很浩瀚的,而且,远未完善。本文的目的,就     

枸杞Lb14-3-3c基因克隆及转化马铃薯的研究

在开花植物中,14-3-3蛋白对植物生长发育具有重要的调控作用。本试验利用逆转录PCR(RT-PCR)技术,从宁夏枸杞宁杞1号花药中克隆了一个14-3-3蛋白家族基因Lb14-3-3c。利用荧光定量PCR技术分析Lb14-3-3c基因在花药发育不同时期的表达特征,构建Lb14-3-3c基因的植物过表达载体pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3c(+)及植物抑制表达载体pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3c(-),继而经农杆菌介导法将过表达载体转化马铃薯紫花白幼茎,获得了阳性转基因马铃薯植株。结果表明,Lb14-3-3c基因编码的蛋白与番茄处于进化树同一分枝上,亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,该基因在枸杞各器官都有表达,在雄蕊中的表达量最高。在花药发育的各个时期均表达,且在小孢子母细胞时期表达量最高。成功将外源基因Lb14-3-3c载入含强启动子CaMV35s的植物表达载体中,并将该基因的植物过表达载体转化马铃薯,通过表型观察与PCR阳性鉴定得到5株转基因植株,发现转基因植株长势优于野生型植株,苗期野生型与转基因型淀粉含量相差不大,结薯期和成熟期转基因型马铃薯的叶片淀粉含量均高于野生型,且差异显著。本研究为进一步探讨Lb14-3-3c基因对枸杞花药发育过程中淀粉供能的调控提供了参考依据,并且为阐明Lb14-3-3c基因在植物发育过程中的功能及枸杞的分子遗传改良提供了研究基础。     

大鼠前体脂肪细胞分化过程中6种基因的表达时序研究

本实验分离培养SD大鼠前体脂肪细胞,以油红O染色计数法区分分化的不同阶段,采用半定量RT-PCR法检测脂肪细胞分化过程中转录因子固醇调控元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBP-1c)、碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate responsive element binding protein,ChREBP)以及脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC1)、硬酯酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)和激素敏感脂酶(hormone sensitive lipase,HSL)基因mRNA表达水平的变化。结果表明,上述基因在前体脂肪细胞阶段均不表达,SREBP-1c、FAS在分化初期表达,SREBP-1c、ChREBP、HSL、FAS、SCD在分化中期表达,6种基因在终末分化阶段均有表达。     

也说肌肉与脂肪

正传说上帝在创造人类的时候,把肌肉给了男人,将脂肪给了女人,这种"肌肉"和"脂肪"不同比例的差异,也许造成了男女之间的诸多不平等。肌肉是力量源泉,脂肪是耐力的象征。肌肉与脂肪的比例多少使得一个人看起来是否更健康,脂肪多的人肌肉比例会少一些,反之肌肉多的人脂肪比例也会多一些。一般没有经过特殊训练的男人的肌肉比例为40%~60%,女人肌肉比例为30%~50%。肌肉在使碳水化合物和脂肪氧化的过程中,消耗掉大量的     

运动和膳食干预对久坐人群的健康影响研究

目的：分析运动和膳食干预对久坐人群的健康影响。方法：2020年1—7月在北京市招募久坐人群108人，根据其近期健康检查数据和血脂数据，将其分肌肉功能减退组和脂肪代谢异常组（干预组、对照组各27人），开展12周的运动和膳食干预。肌肉功能减退组中的膳食方案中供能营养素比例为碳水化合物50%、蛋白质30%、脂肪20%，膳食纤维每天摄入量不少于30 g。脂肪代谢异常组中的膳食方案中供能营养素比例为碳水化合物60%、蛋白质20%、脂肪20%，并分组制定相应的运动干预方案，比较干预前后身体质量情况和血脂数据。结果：肌肉功能减退组，干预组中体重、腰围和BMI显著降低，骨骼肌含量、体脂肪率、内脏脂肪率显著改善（P<0.05）；脂肪代谢异常组，干预组中体重、腰围和BMI显著下降，血液中CHO、TG、HDL-C均有显著改善（P<0.05）。结论：运动和膳食干预能有效提高久坐人群健康状况，并且通过设定个性化、专业的干预方案能有效增加肌肉量，提高肌肉功能，调整机体代谢水平，减少脂肪蓄积。     

特医全营养配方食品配方组成分析

收集国家市场监督管理总局官网公布的已经通过注册的10岁以上全营养配方食品标签说明书，对其配方组成中蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质以及可选择性营养成分进行统计分析，为特医全营养配方食品研制和临床应用提供建议和参考。研究表明，已注册13款产品，蛋白质供能比在14%~20%之间；脂肪供能比在25%~34%之间；碳水化合物供能比多在50%~60%之间；大多数产品维生素的强化量为中国居民膳食营养素推荐量的1~3倍；矿物质的强化量为中国居民膳食营养素推荐量的1~2倍；可选择性营养成分膳食纤维、胆碱、牛磺酸被添加频率较高，氟、肌醇、核苷酸未被添加。我国已注册全营养配方食品配方组成与国外标准肠内营养制剂基本一致。     

七星瓢虫滞育关联基因的转录组学分析

对七星瓢虫正常发育、滞育以及滞育解除的雌成虫进行RNA测序,并对筛选出来的滞育相关基因进行KEGG通路富集分析,从分子水平解析七星瓢虫滞育发机理。本研究以正常发育产卵、滞育30 d以及滞育贮存30 d后解除产卵的七星瓢虫雌成虫为研究对象,分别抽提RNA,合成c DNA,构建c DNA文库,文库检测合格后在Illummina Hiseq 2500测序仪上进行双向测序。根据测序结果,共获取unigene 82820个。采用两两比较法对正常发育组和滞育组、滞育组和滞育解除组进行差异表达分析,分别获得差异表达基因3501个和1427个。深入分析两组比对结果,将在滞育组上调且滞育解除组下调的unigene定义为滞育关联基因,共有443个基因为滞育关联基因。应用KEGG KAAS在线pathway比对分析工具对滞育关联基因进行通路富集分析,结果发现这些基因主要集中在碳水化合物代谢、脂质代谢以及信号转导等途径中。     

结核分枝杆菌Rv1884c基因的克隆及其原核表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv1884c基因的表达蛋白。方法:制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX-4T-1构建质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH5α,再经IPTG诱导表达GST-1884融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式。结果:扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,转化大肠杆菌DH5α后经诱导产生了高水平的表达产物。结论:构建了pGEX-4T-1-Rv1884c质粒载体,并诱导表达了GST-1884融合蛋白,为进一步研究Rv1884c蛋白的活性及其功能,探讨结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

含氮类培养基对海洋微藻Isochrysis zhanjiangensis 油脂与碳水化合物积累的影响

考察了8种含氮培养基对湛江等鞭金藻(I. zhanjiangensis)生长、PSⅡ活性、油脂及碳水化合物积累的影响。结果显示,当培养基中氮浓度为1.5 g/L,藻细胞的总脂肪含量和产量分别达到最高值为39.8 %和 0.92 g/L, 碳水化合物的含量为最低11.6 %;而当培养基中氮浓度为 0.016 g/L,藻细胞的总脂肪含量和产量分别达到最低值为21.1 %和0.16 g/L。而此时总碳水化合物含量最高达到44.4 %。同时线性拟合方程的结果表明培养基中NO₃^-的浓度与藻细胞的总脂含量呈较好的正相关性。因此,通过研究不同含氮水平的培养基实现了脂肪或碳水化合物产量的调控。     

结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c 的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选新基因Collectrin相关蛋白

Collectrin是在小鼠 5 6肾切除后 ,在肾小球的高滤过、高增生期分离克隆的一个新基因 .通过酵母双杂交系统从人肾脏cDNA文库中筛选与collectrin相互作用的蛋白 ,可以为该基因的功能研究提供线索 .构建collectrin的真核表达载体collectrin pGBKT7 c myc ,转化酵母菌AH10 9.Western印迹证实 ,collectrin蛋白能够在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象 .将AH10 9 collectrin pGBKT7 c myc与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,共筛选到 5个与细胞代谢有关的蛋白 ,包括鞘磷脂激活蛋白、精氨琥珀酸合成酶、氨基酸转运蛋白XAT2、NADH脱氢酶 1和金属硫蛋白 2A .由此推论 ,collectrin可能通过与细胞内某些酶类相互作用而影响细胞代谢 ,为新基因collectrin的功能研究提供了重要线索 .     

基于合成致死策略寻找ARID1A突变肝细胞癌的治疗靶点

ARID1A编码的BAF250a蛋白是SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)染色质重组复合物BAF(BRG1-associated factors)的亚基之一,参与改变染色体的结构和可接近性。ARID1A在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的突变率高达13%,但目前尚无有效的治疗药物。本研究旨在利用合成致死策略寻找携带ARID1A突变HCC的治疗新靶标。首先,本研究通过分析ARID1A突变与肿瘤恶性程度的相关性发现ARID1A突变的肿瘤恶性度增加;进而分析Achilles和NCI-60癌症细胞系中ARID1A突变和野生型细胞系的基因表型值(gene phenotype value,GPV)和高表达基因,获得ARID1A突变细胞低GPV和高表达的重叠基因,再扩大样本使用CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)细胞系的高表达基因进行重叠基因分析;最后并在TCGA(the Cancer Genome Atlas)肝癌数据库中进行筛选,获得116个潜在的ARID1A合成致死基因。本研究运用生物信息学方法计算获得多个ARID1A的潜在合成性致死基因,为ARID1A突变HCC患者提供新的治疗靶点,也为靶向药物研发提供了新靶标和新策略。     

中国水仙NtSAMT基因的克隆及转化金鱼藤

本研究以中国水仙花瓣总RNA为模板进行反转录PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收反转录PCR产物,将其与p EASY-T1克隆载体连接并导入大肠杆菌DH5α进行克隆,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。测序结果表明中国水仙花香基因SAMT c DNA的ORF片段1 131 bp编码376个氨基酸残基,与已报导的中国水仙SAMT(JX273470)的同源性为99.2%。将目的基因片段与PBI121表达载体连接,并利用农杆菌介导法将Nt SAMT基因转化到金鱼藤(Asarina procumbens)中,以金鱼藤无菌苗茎段为遗传转化外植体,通过抗性筛选获得12株转化植株,对获得的12株疑似转基因植株进行PCR检测,其中有8株呈阳性;通过RT-PCR检测得到的阳性植株,其中有5株呈阳性。检测结果表明,该研究成功克隆水仙花Nt SAMT基因并在金鱼藤植物中得到表达。     

1991-2015年我国十五省（区）农民膳食能量及宏量营养素摄入的变化趋势及其人口学特征

目的：分析中国15省（区）农民膳食能量和宏量营养素摄入现状和变化趋势。方法：利用“中国健康与营养调查” 1991—2015年间膳食随访数据,以18岁及以上的农民作为研究对象。采用连续3d 24h膳食回顾法和家庭称重记账法收集膳食资料,借助食物成分表将食物消费量转换成能量及各类营养素摄入量。结果：2015年我国15省（区）农民能量摄入量为1 891.5kcal/d,蛋白质、脂肪和碳水化合物的平均摄入量分别为55.4、66.0、245.2g/d,其供能比分别为12.0%、33.2%和54.0%。与1991年相比,能量、蛋白质、碳水化合物摄入量分别下降了521.7kcal/d、13.7g/d、152.0g/d,脂肪摄入量增加了18.1g/d,蛋白质供能比基本持平,碳水化合物供能比减少了10.8%,脂肪供能比增加了10.6%。2015年,65岁及以上农民的能量、蛋白质和脂肪摄入量均低于其他年龄组,碳水化合物的摄入量随年龄组的升高而降低,低收入农民的能量和碳水化合物摄入量高于中、高收入农民。谷类食物、其他食物、食用油分别为能量、蛋白质、脂肪的主要来源。结论：中国15省（区）农民蛋白质和碳水化合物供能比合理,脂肪供能比较高,应根据农民不同的收入水平和生理条件开展针对性的营养指导。     

饮食结构与糖尿病发生发展相关性探究

目的：探讨饮食结构与糖尿病患者病情发生发展的相关性。方法：选取2018年8月—2019年8月于我院接受治疗的2型糖尿病（T2DM）患者80例，根据患者饮食结构类型的不同，将患者分为A组（高碳水化合物组）40例、B组（高蛋白高脂肪组）40例，同时随机选取同期入院健康体检的正常人群40例为对照组。3组患者在均签署知情同意书。所有入组人员接受血常规检查、肾功能指标检查以及饮食结构分析，采用单因素分析以及Logistics回归分析方法，分别研究饮食结构与糖尿病发生、发展的关系。结果：血液糖尿病常规检查：对照组人群FPG、2hPG、HbA1c明显低于A、B两组，B组TC、TG、LDL-C明显高于A组和对照组，HDL-C明显低于A组和对照组，B组HbA1c明显高于A组；饮食结构评价：A组碳水化合物摄入供能占比明显高于B组和对照组，对照组脂肪摄入供能占比明显低于A、B两组，B组蛋白质摄入供能占比明显高于A组和对照组，以上差异均具有统计学意义（P<0.05）。胰岛功能检查：A组FINS明显高于B组和对照组，HOMA-β明显高于B组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。以患者FPG水平作为分类变量（FPG<10 mmol/L=0、FPG 10 mmol/L=1），饮食结构评价结果指标作为协变量，做多因素Logistics回归分析，结果显示：碳水化合物摄入供能占比与FPG水平表现为正相关（P=0.032，OR=1.234），脂肪摄入供能占比与FPG水平表现为正相关（P=0.017，OR=1.416）。结论：高碳水化合物以及脂质蛋白质的摄入均是引发糖尿病的影响因素，而后者可能影响程度更大，我国居民应形成健康的饮食结构。     

小鼠胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式

将PPARγ2基因启动子和报告基因荧光素酶相连接克隆于特定载体构建成表达质粒,电穿孔转染小鼠ES细胞,筛选阳性克隆.诱导ES细胞向脂肪细胞分化,通过定量检测荧光素酶活性跟踪PPARγ2基因的表达情况,以此研究脂肪细胞分化过程中该基因的表达模式.结果显示PPARγ2基因在未分化的ES细胞和EB形成的前两天中不表达,从EB形成的第3天开始表达,直至脂肪细胞分化完成.该基因在已完成分化的脂肪细胞中的表达远强于在分化中的前脂肪细胞中的表达.首次报道了从小鼠ES细胞到脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式,支持了PPARγ2基因为脂肪组织特异性表达基因的已有报道,并为脂肪细胞分化机理研究提供了线索.     

人细胞色素c基因在大肠杆菌中的克隆和表达及活性测定

通过PCR方法 ,从人胎儿心肌基因组DNA中得到precytc基因 (有 1个内含子 ) ,剔除内含子后 ,得到细胞色素c基因的编码序列 .测序结果表明 ,该基因与GenBank中报道的人细胞色素c基因核苷酸顺序完全一致 .将其插入原核表达载体pET3a的NdeⅠ和HindⅢ位点之间构建pET3a cytc重组质粒 ,并成功转化入E .coliBL2 1(DE3)中 .经IPTG诱导表达后 ,15 %SDS PAGE分析 ,可观察到1条与细胞色素c蛋白分子量相符的电泳条带 .Western印迹结果显示 ,该条带与小鼠抗人cytc单克隆抗体IgG2b发生特异反应 ,证实为人细胞色素c的前体蛋白 .体外使血红素与该前体蛋白结合生成完整的人细胞色素c蛋白 ,其耗氧量在不同浓度具有与反应时间的线性关系 ,为研究人细胞色素c结构和功能关系奠定了基础